Breathomics - Krankheiten „erriechen“
Die exhalierte Luft enthält zahlreiche organische Substanzen. Breathomics werden wohl in Zukunft bei der Diagnostik und Verlaufskontrolle von Erkrankungen der Lunge, aber beispielsweise auch des Darms oder des Gehirns, eine wichtige Rolle spielen.
Schlüsselwörter: VOC, Exhalom, Volatilom, Massenspektrometrie
Das Erkennen von Krankheiten mithilfe unseres Geruchssinns spielt seit der Antike eine große Rolle in der Medizin. Schon damals vermuteten Hippocrates und andere Gelehrte, dass sich Stoffwechselvorgänge, die sich im Körperinneren abspielen, auf die Ausatemluft auswirken, und dass durch deren Analyse die Diagnose von Krankheiten möglich sein könnte. Beispielsweise können bei der Untersuchung der Ausatemluft von Patienten ein „obstartiger“ Aceton-Geruch beim hyperglykämischen Koma, ein harnähnlicher Foetor uraemicus bei Urämie oder ein Foetor hepaticus bei Lebererkrankungen unterschieden werden [1].
Vor über 240 Jahren wurde nach einer technischen Analyse der exhalierten Luft erstmals über den Gehalt von Kohlendioxid (CO2) berichtet. Heute wissen wir, dass die ausgeatmete Luft Stickstoff (N2), Sauerstoff (O2), CO2 und Wasser (H20) enthält [1, 2]. Und vor über 110 Jahren wurde von Arthur Cushny gezeigt, dass es Zusammenhänge zwischen der pulmonalen Exhalation von flüchtigen organischen Substanzen (Chloroform, Aceton u. a.) nach intravenöser Injektion sowie deren spezifischen chemischen Eigenschaften gibt: je geringer die Wasserlöslichkeit, desto höher die Konzentration der Substanz im Exhalat [3]. Der Begriff „flüchtige organische Verbindungen“ (volatile organic compounds, VOCs) wurde im letzten Jahrhundert von einigen Wissenschaftlern, u. a. dem Nobelpreisträger Pauling [4], geprägt. Systematische Untersuchungen zeigten erste Zusammenhänge zwischen bestimmten VOCs und Krankheiten. Die VOCs gelangen vom Blut mittels passiven Transports durch die alveolaren Membranen der Lunge in die ausgeatmete Luft. Die Messung dieser endogenen Spurengase kann wichtige Erkenntnisse über physiologische und pathophysiologische Prozesse im Organismus liefern.
Der erste Meilenstein zur modernen Analyse volatiler organischer Verbindungen wurde 1971 gelegt, als Pauling et al. bei der gaschromatografischen Untersuchung von Atemwegsexhalat und verflüchtigtem Urin jeweils über 200 verschiedene Substanzen in separaten Proben nachweisen konnten [4]. In den 80er-Jahren gelang es, einzelnen Krankheitsbildern bestimmte flüchtige Metaboliten zuzuordnen [5]. So konnten Gordon et al. 1985 verschiedene Alkane in der Ausatemluft von Patienten mit Lungenkrebs nachweisen [6].
Phillips et al. gelang es 1999, anhand einer Kombination identifizierter Alkane und Benzene mit hoher Sensitivität und Spezifität zwischen Lungenkrebspatienten und gesunden Kontrollprobanden zu unterscheiden [7]. Aufgrund technischer Verbesserungen und vereinfachter Durchführbarkeit von Messungen an Patienten stieg das medizinwissenschaftliche Interesse an der Analyse von VOCs in den vergangenen Jahren kontinuierlich an [8].
Exhalom und Volatilom
Als „Volatilom“ bezeichnet man den Pool von VOCs aus sämtlichen Kompartimenten des menschlichen Körpers, z. B. aus den Atemwegen, dem Speichel, dem Blut, der Muttermilch, dem Schweiß, dem Urin oder den Faeces [9]. Alles deutet darauf hin, dass Veränderungen in Konzentration oder Muster mehrerer Komponenten im Spektrogramm bzw. das Neuauftreten von VOCs charakteristisch für einzelne Erkrankungen ist. Die quantitative Zusammensetzung des Volatiloms lässt sich zum heutigen Zeitpunkt noch nicht erfassen.
Das Exhalom, die Gesamtheit der VOCs in der Ausatemluft, kann dagegen in nano- bis picomolaren Konzentrationen quantifiziert werden. Die Gaschromatografie-gekoppelte Massenspektrometrie stellt für die Analyse der Ausatemluft bislang den Goldstandard dar [2, 10]. Die hierfür verwendeten Geräte sind jedoch nicht mobil einsetzbar sowie kostenintensiv und erfordern große technische Vorkenntnisse. Daher werden für die bettseitige Anwendung neuere Entwicklungen, wie eine „elektronische Nase“ oder ein Ionenmobilitätsspektrometer (IMS), genutzt. So kann die Analyse direkt am Patientenbett ohne eine vorherige Probenaufbereitung stattfinden.
Bei der Detektion von VOCs muss man zunächst den Ursprung der erfassten VOCs differenzieren. Das Volatilom wird über die menschliche Haut, Faeces, Urin oder die Ausatemluft „freigesetzt“, womit jedoch keine Aussage über den ursprünglichen Entstehungsort der volatilen Substanzen getroffen werden kann. Grundsätzlich sind in unserer Atemluft enthaltene endogene, im Körperinneren entstandene VOCs, von den exogenen, aus der Umgebung des Patienten stammende VOCs, zu unterscheiden. Exhalierte endogene VOCs können entweder lokalen Ursprungs sein, und somit direkt aus dem Bereich des oberen und unteren Respirationstraktes stammen, oder VOCs systemischer Herkunft, welche indirekt über den Blutkreislauf in die Alveoli der Lunge gelangen und schließlich abgeatmet werden (Abb. 1).
Folglich müssen vor der Identifikation der VOCs in der Ausatemluft zunächst die kontaminierenden Substanzen, d. h. die aus der Umgebungsluft oder aus technischen Geräten stammenden Verbindungen, identifiziert werden. Bei beatmeten Patienten kann hier vor allem das Beatmungsgerät selbst sowie das zur Beatmung genutzte Gasgemisch eine Quelle von interferierenden Substanzen sein [2]. Diese Hintergrundsignale können je nach eingesetztem Messverfahren die Identifikation abgeatmeter Substanzen erschweren.
Biomarker
Ziel aktueller Forschungsaktivitäten ist die Identifizierung von Biomarkern, die sich sowohl für die Diagnostik als auch die Verlaufskontrolle und Differenzialtherapie eignen. Voraussetzung ist, dass diese Biomarker eine ausreichend hohe Spezifität und Sensitivität aufweisen. Sie sollten idealerweise auch eine Frühdiagnose sowie die Beurteilung des therapeutischen Ansprechens und des Krankheitsverlaufs ermöglichen. Besonders vorteilhaft ist die non-invasive Probengewinnung, die regelmäßige Kontrollen erlaubt – insbesondere auch bei Neugeborenen, Kleinkindern und älteren Patienten mit für die Blutentnahme ungünstigen Venenverhältnissen. Praktische Anwendung verspricht man sich bei der Frühdiagnose des Bronchialkarzinoms, der differenzialdiagnostischen Abklärung von entzündlichen Lungenerkrankungen bzw. von Infektionen, insbesondere bei der Lungen-Tuberkulose, und der Abgrenzung von Asthma und COPD (chronisch-obstruktive Lungenerkrankung) [11, 12].
Analyse
Mittels Massenspektrometrie lassen sich geladene Ionen im Vakuum bestimmen. Dafür müssen die zu analysierenden Substanzen zunächst ionisiert werden, indem ein elektrisches Feld die ionisierten Moleküle/Teilchen beschleunigt. Eine Auftrennung der Ionen erfolgt anhand des Verhältnisses von Masse zu Ladung. Vorteilhaft ist eine Kombination der Vortrennung durch Gaschromatografie mit der Massenspektrometrie (GC-MS) [2, 13–14]. Sehr ausführlich erörtert bzw. diskutiert eine Übersichtsarbeit von Wallace und Pleil verschiedene Sensoren und MS-Techniken im Zusammenhang mit Breathomics (Abb. 2; modifiziert nach [2]).
Tierische Detektoren
Eine nicht-apparative Analyse von VOCs soll an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben: Auch Tiere (z. B. Hunde – canine olfaction) können bei der Diagnosestellung helfen [2]. Dass Hunde Tumoren oder Durchfallerkrankungen mit Clostrioides difficile erschnüffeln können, ist keinesfalls eine neue Erkenntnis [15]. Neu ist allerdings die Genauigkeit des tierischen „Detektors“ für spezifische Tumorerkrankungen oder Infektionskrankheiten, z. B. der Harnwege oder des Gastrointestinaltrakts. Hunde haben eine im Vergleich zum Menschen 300-fach höhere Geruchsempfindlichkeit, d. h. sie können die geringsten Konzentrationen von VOCs erfolgreich erschnüffeln.
Gut trainierte Hunde sind laut einer neueren Untersuchung in der Lage, maligne solitäre Lungenrundherde (solitary pulmonary nodule, SPN) genau zu identifizieren [16]. In dieser Studie wurden 90 Exhalatproben von 30 Patienten mit Lungenkrebs gesammelt – also je 3 pro Patient. Die Kontrollgruppe bestand aus 61 gesunden Probanden und 18 COPD-Patienten ohne Lungenkrebs oder maligne Lungenrundherde, von denen jeweils 5 Exhalatproben (n = 395) genommen wurden. Der Hund „Blat“, ein vier Jahre alter Labrador-Pitbull-Mix, erkannte bei 27 von 30 Patienten mit SPN Lungenkrebs und identifizierte 3 als lungenkrebsnegativ. Diese Ergebnisse stimmten vollständig mit den postoperativen pathologischen Ergebnissen überein. Die Sensitivität betrug 97 % und die Spezifität lag bei 99 %. Der positive Vorhersagewert betrug 97 % und der negative Vorhersagewert 99 %. Guirao et al. [16] betonen, dass geschulte Hunde Lungenkrebs im Exhalat selbst dann mit hoher Genauigkeit anzeigen, wenn die Tumoren < 3 cm sind und sich als solitäre Lungenrundherde präsentieren. Des Weiteren ist die diagnostische Fähigkeit trainierter Hunde im Vergleich zu den bisher getesteten elektronischen Nasen spezifischer und sensitiver.
Auch in der Infektionsmedizin ist der Einsatz von geschulten Hunden, z. B. bei Patienten mit Clostridioides-difficile-assoziierter Durchfallerkrankung (CDAD), oder von afrikanischen Riesenratten, die eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis erschnüffeln können, seit Jahren bekannt [15]. Folglich ist die Idee naheliegend, dass man für die jeweilige Erkrankung trainierte Tiere mit der „elektronischen Nase“ kombiniert, um die diagnostische Spezifität und Sensitivität in manchen Fragestellungen enorm zu erhöhen.
Mikrobiologie
Entzündungen des oberen oder unteren Respirationstraktes werden häufig durch bakterielle oder virale Infektionserreger ausgelöst. Der Nachweis erfolgt mithilfe herkömmlicher mikrobiologischer sowie innovativer molekularer Methoden. Mit Ausnahme von Point-of-care-Technologie (POCT) erlauben die bisherigen Verfahren eine Befundung innerhalb von wenigen Stunden bis wenigen Tagen. Um therapeutische bzw. präventive Maßnahmen frühzeitig einleiten zu können und dadurch den Therapieerfolg zu verbessern, ist häufig eine rapide mikrobiologische Diagnostik notwendig. Über In-vitro-Untersuchungen der mikrobiellen VOCs konnten Zusammenhänge mit den entsprechenden respiratorischen Infektionen aufgezeigt werden. Direkte In-vivo-Untersuchungen des Volatiloms in den letzten Jahrzehnten ermöglichen die Zuordnung der „spezifischen“ Metaboliten zu den respektiven mikrobiellen Infektionen anhand von Atemluftanalysen oder Serum-Analysen [17, 18].
SARS-CoV-2
Auch in Zusammenhang mit dem aktuellen Pandemie-Virus SARS-Corona-Virus-2 (SARS-CoV-2), dem Erreger der Viruspneumonie COVID-19, sehen wir die Streubreite der Turn-around-Zeiten (TAT: Stunden bis wenige Tage) bis zur Befundung als logistisches und diagnostisches Dilemma in der direkten Versorgung von COVID-19-Patienten. Hierfür werden im Rahmen der Ausschreibung des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) Projektideen formuliert, die SARS-CoV-2 und COVID-19 adressieren. Um die momentane lange Diagnostikzeit über molekulare Verfahren, RT-PCR, auf wenige Minuten zu verkürzen, werden Projekte skizziert, die sich mit der Entwicklung bzw. Etablierung von In-vivo-Breathomics bei SARS-CoV-2-infizierten Patienten beschäftigen.
Eine der möglichen Applikationsmethoden stellt die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) dar: Hier liegen die Spektren der VOCs meist innerhalb weniger Sekunden vor. IMS-Geräte können miniaturisiert werden, wodurch eine anwenderfreundliche robuste Applikation möglich ist. Darüber hinaus ist eine solche Anwendung kosteneffektiv und aufgrund der kurzen Analysenzeit für mobile, kontinuierliche Online-Messungen geeignet.
Standardisierung
Generell müssen jedoch vor solchen in-vitro- bzw. in-vivo-diagnostischen Erwägungen Standardisierungen und Harmonisierungen von Breathomics-Teilschritten, insbesondere bei der Gewinnung bzw. beim Volumen des Exhalats und Einsatz von Analysemethoden, definiert werden [19–21].
Die geringen Konzentrationen der Metaboliten in der Atemluft im Bereich einiger ppmv bis ppbv (nmol/l–pmol/l) machen eine Voranreicherung erforderlich. Darüber hinaus ist die Fragestellung zu erörtern, welche Fraktion des Exhalats für die direkte bzw. indirekte Untersuchung standardisiert werden soll. Bisher wendet man folgende Methoden an: Kühlfallen, adsorptive Bindung, chemische Bindung oder Kryofokussierung. Die Gewinnung des Exhalats bei der indirekten Bestimmung der VOCs erfolgt mithilfe von Glasflaschen, Beuteln oder Kanistern [2, 19, 22–24].
Bei der Applikation dieser innovativen Technologien müssen weitere Variablen hinsichtlich Standardisierung und Harmonisierung der Methoden – zusätzlich zur Art der Probengewinnung – berücksichtigt werden, die zu Konzentrationsunterschieden der VOCs führen können: Begleiterkrankungen, Alter, Geschlecht, Beruf und Rasse des Patienten, Diät sowie kürzlich stattgehabte Exposition mit chemischen Noxen u. a. [20].
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