Rationale Stufendiagnostik

Vor den grundlegenden Arbeiten von Rudolf Virchow und Paul Ehrlich fußte die wissenschaftlich orientierte Beurteilung von krankhaften Veränderungen allein auf der genauen Befragung, der sorgfältigen körperlichen Untersuchung und der Verlaufskontrolle. Als Beispiel dafür steht die von Paul Gottlieb Werlhof (1695–1740) beschriebene und nach ihm benannte hämorrhagische Diathese der Thrombozytopenie. Seit dem 19. Jahrhundert wurden zahlreiche Untersuchungsverfahren entwickelt, die es erlauben, pathophysiologisch definierte Dia­gnosen zu stellen. Zytologie, Histologie, Zytochemie, Immunzytologie/-histologie, Zyto- und Molekulargenetik sind heute in der klinischen Diagnostik nicht mehr wegzudenken. Viele der modernen Verfahren sind zeit- und kostenaufwendig. Sie müssen deshalb differenziert zum Einsatz kommen und dürfen nicht pauschal als Ersatz für einen mangelhaften Kenntnisstand der mit der Untersuchung beschäftigten Ärzte dienen. Für eine rationale Diagnostik lassen sich die verschiedenen Untersuchungsmethoden fünf Kategorien, hier Stufen genannt, zuordnen (Tab. 1). 

Im Folgenden wird gezeigt, wie man die zur Verfügung stehenden diagnostischen Möglichkeiten sinnvoll einsetzt, wann man mit der Stufe 1 auskommt und wann alle fünf Schritte erforderlich sind, um eine valide Diagnose zu stellen.
 

Stufe 1: rationale Diagnostik einer Anämie

Ausgangspunkt einer spezifischen hämatologischen Diagnostik ist neben Anam­nese, körperlicher Untersuchung, Laborchemie und Bildgebung die Untersuchung des peripheren Blutes. Damit werden als Basisinformationen Anämie, Thrombopenie, Leukopenie beziehungsweise Polyglobulie, Thrombozytose sowie Leukozytose singulär oder kombiniert erfasst. In vielen dieser Fälle kann die Diagnose mit den Möglichkeiten der Stufe 1 verlässlich gestellt werden. Ein Beispiel dafür ist die isolierte Anämie (A). Bei pathophysiologischer Betrachtung werden zunächst die Erythrozytenindizes angesehen. Sie erlauben die Unterteilung der Anämie nach dem Hämoglobingehalt der Erythrozyten in normo-, hypo- und hyperchrom sowie nach deren Größe in normo-, mikro- und makrozellulär. Bei einer hypochromen, mikrozellulären A muss zuerst Ferritin im Serum bestimmt werden. Ein Wert < 12 µg/l beweist einen kausalen Eisenmangel. Dieser Befund bedarf, unabhängig vom Schweregrad der A, keiner speziellen hämatologischen Dia­gnostik. Eine vergleichbare Aussage hat eine Transferrinsättigung von < 20 %. Wichtig für das diagnostische Work-up: Die Eisenmangelanämie ist ein Symptom, das hinsichtlich der Ursache internistisch oder gynäkologisch geklärt werden muss. Bei einer hypochromen A mit normalem oder erhöhtem Serumferritin kommen ursächlich eine zugrundeliegende chronische Erkrankung oder eine Thalassämie infrage. Ein Algorithmus kann hier bei der Abklärung helfen (Abb. 1).
 

Retikulozyten als jugendliche Erythrozyten haben eine hohe diagnostische Aussagekraft. Ihre Bestimmung darf bei keiner Anämiediagnostik fehlen. Bei einer A mit erhöhten Retikulozytenzahlen ist die Differenzialdiagnose begrenzt. Ursächlich kommen dafür eine gesteigerte Hämolyse, ein Zustand nach kürzlich stattgehabtem, relevantem Blutverlust oder eine Substitution mit Eisen, Folsäure oder Vitamin B12 in Betracht. In diesen Fällen ist eine Knochenmarkuntersuchung nicht erforderlich. Eine hyperchrome A mit niedrigen Retikulozyten verlangt als erstes die Bestimmung von Vitamin B12 und Folsäure. Bei deren Verminderung kann auf eine Knochenmark(KM)-Diagnostik verzichtet und stattdessen eine Ursachenklärung veranlasst werden (Abb. 2).

Stufe 2, Schritt 1: mikroskopische Ausstrichsdiagnostik

Bei vielen Veränderungen des Blutes ist die sachkundige Untersuchung eines pan­optisch gefärbten Ausstrichs im Mikroskop entscheidend – entweder für die Diagnose als solche oder zur Weichenstellung für den weiteren Untersuchungsgang.
Beispiele einer definitiven Diagnose, basierend auf der Stufe 1 und kompetenter mikroskopischer Ausstrichsdiagnostik, sind die Immunthrombozytopenie, Mononukleose, Agranulozytose, hämophagozytische Lymphohistiozytose, Leishmaniose, um einige Erkrankungen dieser Gruppe zu nennen [1]. In anderen Fällen wird die Information des Differenzialblutbildes zum Ausgangspunkt für die Folgeuntersuchungen, z. B. bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML) oder den myelodysplastischen Syndromen (MDS). Bei einer exzessiven neutrophilen Leukozytose mit Linksverschiebung bis zu Myeloblasten und einer Vermehrung basophiler Granulozyten bestätigt der Nachweis des Philadelphia-Chromosoms und des BCR/ABL-Fusionsgens die Diagnose der CML. Bei einer BCR/ABL-negativen myeloproliferativen Neoplasie nach den Stufen 1 und 2 ist die zusätzliche Molekulargenetik, entsprechend Stufe 5, diagnoseentscheidend.
Grundlage der Feststellung eines MDS ist die zytologische Beurteilung eines Pappenheim-gefärbten Ausstrichs von Blut und Knochenmark [2, 3]. Zur Sicherung der Diagnose sind neben der Erfassung von Vorerkrankungen und deren Behandlung das numerische Ergebnis des Blutbildes, die Zytogenetik und – aus prognostischen Gründen – auch zunehmend die Molekulargenetik erforderlich. Eine alle Aspekte des MDS umfassende Beurteilung dieser häufig schwierig zu stellenden Diagnose verlangt den Einsatz aller fünf Diagnosemodalitäten [4].

Zytochemie
Im Gegensatz zur hohen Zeit der FAB-Klassifikation in den 1970er-Jahren hat die Zytochemie an Bedeutung verloren. Zur diagnostischen Sicherung einer akuten mye­loischen Leukämie werden weiterhin die Enzymreaktion der Peroxidase und Esterase durchgeführt. Die Durchflusszytometrie hat sich für die Zytochemie zur ernsthaften Konkurrenz entwickelt. Unbestritten ist jedoch der Platz der Eisenfärbung: Wenn es sich um die Klärung einer Anämie handelt, ist die Berliner-Blau-Reaktion im Knochenmark weiterhin unverzichtbar. Eine besondere Rolle spielt der Nachweis von Ringsideroblasten. Das gilt explizit für die Diagnosegruppe des MDS.

Stufe 2, Schritt 2: histologische Untersuchung

Knochenmark
Die Gewinnung einer Beckenstanze ist bei Verwendung der Jamshidi-Technik einfach, mit geringem Risiko verbunden und wird deshalb häufig routinemäßig neben der Aspiration durchgeführt. Bei einigen Diagnosen, wie bei der akuten Leukämie, bieten die KM-Schnitte keine zusätzliche Information, wenn bei der Aspiration genügend auswertbares Material gewonnen wurde. Praktikabel ist neben der Aspiration die routinemäßige Gewinnung eines Stanzzylinders, der jedoch erst dann in die Pathologie geschickt wird, wenn nach der zytologischen Untersuchung diagnostisch offene Fragen bleiben. Wenn der KM-Ausstrich eine Enddiagnose erlaubt, kann die Stanze verworfen werden.
Bei einer Reihe von Erkrankungen ist die histologische Untersuchung der Beckenstanze obligat. Das trifft für alle myeloproliferativen Neoplasien zu, um den Grad einer primären oder sekundären Fibrose und eine atypische Verteilung der hämatopoetischen Kompartimente im Markraum beurteilen zu können. Die Diagnose einer primären Myelopoese ist ausschließlich am Schnitt der Beckenstanze mit Gitterfaserfärbung möglich. Dies gilt auch für eine sekundäre Myelofibrose nach einer vorausgegangenen Polycythaemia vera oder einer essenziellen Thrombozythämie. Gleichermaßen unverzichtbar ist die KM-Histologie zur Beurteilung einer KM-Beteiligung bei einem Hodgkin- oder Non-Hodgkin-Lymphom, da sich lymphatische Neoplasien in den Markräumen nodulär ausbreiten können und deshalb bei einer alleinigen Aspiration dem Nachweis entziehen.
Bei der systemischen Mastozytose (SM) sind Aggregate von ≥ 15 Mastzellen im KM-Schnitt nach den gültigen WHO-Kriterien das diagnostische Hauptkriterium. Die Feststellung einer aplastischen Anämie ist mit Verlässlichkeit nur histologisch möglich. Desgleichen ist bei einer Punctio sicca die histologische Untersuchung der Beckenstanze diagnostisch entscheidend.

Lymphknoten und andere Gewebe
In den meisten Fällen diagnostiziert man eine nicht leukämisch verlaufende Lymphadenopathie histologisch aus einem exstirpierten Lymphknoten oder einer gezielt entnommenen Nadelbiopsie aus diesen oder aus anderen Geweben.

Stufe 3: Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie (FCM) stellt eine wesentliche Bereicherung der zellgebundenen Diagnostik dar. Sie ist eine wichtige Methode zur Charakterisierung wenig differenzierter Zellen. Sie hilft, die große Variabilität der Lymphozyten zuzuordnen und ist entscheidend für die Abgrenzung einer reaktiven von einer neoplastischen Lymphozytose. Der Ausschluss oder der Nachweis einer Monoklonalität von reifen B-Lymphozyten gelingt mit der FCM verlässlich. Auch bei der Klassifizierung akuter Leukämien hat die FCM einen festen Platz (Abb. 3). 

Sie dient zum einen der Erfassung aberranter Expressionsmus­ter, wie zum Beispiel dem Vorhandensein lymphatischer Marker bei einer akuten myeloischen Leukämie. Ein individueller Leukämie-assoziierter Immunphänotyp ist zur Bewertung der minimalen residualen Erkrankung (MRD) von großer praktischer Bedeutung [5].
Die FCM ist entscheidend für die Klassifizierung der akuten undifferenzierten Leukämie. Die Einteilung der akuten lymphatischen Leukämie nach den EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias)-Kriterien basiert auf dem Ergebnis der FCM [6].
Bei der gleichzeitigen mikroskopischen und durchflusszytometrischen zytologischen Untersuchung können zahlenmäßige Abweichungen in einigen Zellkompartimenten auftreten. Blasten werden bei der FCM in geringerer Zahl als im Ausstrich gefunden, wenn die Progenitorzellen kein TdT, CD34 oder CD117 exprimieren. Der Anteil kernhaltiger roter Vorstufen im Knochenmark ist durchflusszytometrisch häufig geringer als im Mikroskop, da bei der FCM zur Beseitigung der Erythrozyten eine Hämolyse erforderlich ist, die ungewollt auch einen Teil der Erythroblasten zerstört. Plasmazellen können in der FCM ebenfalls in geringerer Zahl als im Ausstrich gefunden werden.
Einen dia­gnosesichernden Platz hat die FCM zum Nachweis der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie (PNH), da der Defekt der GPI-Ankerproteine direkt sichtbar gemacht werden kann.
Der Nachweis der aberranten Expression von CD2 und/oder CD25 auf CD117-positiven Mastzellen bestätigt die neoplastische Natur dieser Zellen als zytologische Kronzeugen einer systemischen Mastozytose [7].
Die FCM kann auch helfen, die Diagnose eines MDS zu sichern. Eine Lineage Infidelity und die Ermittlung des Blastenanteils sind geeignet, die Diagnose eines MDS zu etablieren, und leisten einen Beitrag zur Prognose dieses so heterogenen Syndroms.
Entbehrlich ist die FCM zur Erstdiagnose der myeloproliferativen Neoplasien. Hier liefert die Methode keine zusätzliche Information, auch nicht bei der Mehrzahl einer isolierten Anämie oder Thrombozytopenie [8].

Stufe 4: Zytogenetik

Vor allem bei neoplastischen Erkrankungen der Hämatopoese hat die ergänzende Chromosomenanalyse aus Gründen der Dia­gnosefindung, der Prognosebewertung und der bestmöglichen Therapie einen zentralen Platz. Markante Beispiele dafür sind die akuten Leukämien, die myeloproliferativen Neoplasien und die myelodysplastischen Syndrome. Es sei daran erinnert, dass die chronische myeloische Leukämie mit dem Nachweis der Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 durch Peter Nowell und David Hungerford 1960 in Philadelphia die erste genetisch definierte Krankheit war [9].
Einige Formen der akuten myeloischen Leukämie der WHO-Klassifikation 2016 sind primär zytogenetisch charakterisiert [10]. Das betrifft die chromosomalen Aberrationen t(8;21), t(15;17) oder inv(16) bzw. t(16;16). Die Sonderstellung dieser Formen kommt dadurch zum Ausdruck, dass für diese nicht die sonst übliche diagnostische Mindestforderung von ≥ 20 % Blasten im Blut oder KM erfüllt sein muss [11]. Zugleich erlaubt das Karyogramm eine Zuordnung zu den Prognosegruppen: günstig, intermediär, ungünstig.
Gleichermaßen ist die Zytogenetik bei einem MDS essenziell. Aberrationen an den Chromosomen 5 und 7 sind sowohl für die diagnostische Zuordnung als auch für die prognostische Vorhersage und die Therapie wichtig.
Die Erstellung eines vollständigen Karyogramms ist zeitaufwendig. In Situationen, in denen schnellstmöglich eine zytogenetische Analyse nötig ist, wie z. B. im Verdachtsfall einer akuten Promyelozytenleukämie, kann eine selektive Sofortbestimmung einer chromosomalen Aberration mithilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) infrage kommen. Die FISH-Diagnostik liefert ein tagesgleiches, verlässliches Untersuchungsergebnis, ersetzt aber nicht das klassische Karyogramm, das eine Beurteilung des gesamten Genoms erlaubt.

Stufe 5: Molekulargenetik

Die Molekulargenetik gehört zur Standarddiagnostik einer akuten Leukämie – nicht aus Gründen der Diagnosestellung, sondern zur Beurteilung der individuellen Prognose [12]. In einigen Fällen erlaubt das Untersuchungsergebnis eine spezielle, personalisierte Therapie. So ist bei AML-Patienten mit normalem Karyotyp der Nachweis der Mutationen NPM1 und CEBPA mit einem günstigen Verlauf, beziehungsweise bei den Mutationen FLT3-IDT, ASXL1, TP53 mit einer geringeren Kurationsrate zu rechnen. Das Vorliegen der prognoseungünstigen FLT3-IDT-Mutation macht die zusätzliche Gabe von Midostaurin zur Standard-Chemotherapie sinnvoll und bewirkt eine höhere Rate kompletter Remissionen.

Minimal residuale Erkrankung
Die Zyto- und Molekulargenetik sind, wie die FCM, bei zahlreichen hämatopoetischen Neoplasien zur Beurteilung der minimalen residualen Erkrankung geeignet und dafür von herausragender Bedeutung. Die molekulargenetischen Aberrationen BCR/ABL, JAK-2, Calreticulin und MPL sind essenziell zur Unterscheidung zwischen benignen und malignen Veränderungen der Hämatopoese. Diese Mutationen erlauben zudem eine prognostische und differenzialtherapeutische Beurteilung dieser Erkrankungen. Das BCR/ABL-Fusionsgen bildet die Grundlage der individualisierten Therapie und der Verlaufskontrolle unter einem Tyrosinkinase-Inhibitor. Das molekulargenetische Monitoring entscheidet über die Qualität der Behandlung und erlaubt zudem die Entscheidung über eine Beendigung der Therapie der CML ohne Nachteil für den weiteren Verlauf.

Persistierende Eosinophilie
Diagnoseentscheidend ist die Polymerasekettenreaktion zur Beurteilung einer persistierenden Eosinophilie. Der Nachweis der Mutation FIP1L1-PDGFRA ergibt in diesem Falle die Diagnose einer myeloischen Neoplasie mit Eosinophilie und Rearrangement von PDGFRA [13]. Diese Feststellung eröffnet zugleich die Möglichkeit einer erfolgreichen Behandlung mit einem Tyrosinkinase-Inhibitor. Aus pragmatischen Gründen werden im Rahmen des Next Generation Sequencing (NGS) Gruppen von genomischen Mutationen analysiert, um nach Möglichkeiten für eine zielgerichtete Therapie zu suchen.

Integrierter Befund

Die Daten der Untersuchungsstufen 1 bis 5 werden in der Regel in unterschiedlichen Institutionen erhoben. Für die klinische Wertigkeit ist eine Gesamtschau aller Befunde durch einen kundigen Hämatologen mit hoher fachlicher Expertise erforderlich. Ein solcher zusammenfassender Befund erlaubt eine bestmögliche Beurteilung der Prognose und ermöglicht eine individualisierte Therapie [8].

Fazit

So wenig Diagnostik wie möglich und so viel Diagnostik wie nötig: Praktisch heißt das, in der Mehrzahl der benignen Veränderungen genügen die Stufen 1 und 2. Für neoplastische Erkrankungen muss sich der Umfang der Untersuchungen an den Anforderungen des blauen Buchs der WHO [12] orientieren. Bei den meisten hämatologischen Neoplasien müssen alle fünf Diagnostikmodalitäten zum Einsatz kommen. Als Beispiel dienen die diagnostischen Kriterien der Polycythaemia vera (Abb. 4).

Basis des diagnostischen Prozedere ist die kompetente Beurteilung des panoptisch gefärbten Ausstrichs des peripheren Blutes und/oder des Knochenmarks.