Breathomics bei Patienten mit Asthma bronchiale sowie COPD: Lassen sich Lungenerkrankungen differenzieren?

Atemwegserkrankungen – einschließlich Asthma bronchiale und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) – nehmen weltweit zu. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtete, dass die oben genannten Krankheiten am häufigsten mit dem Rauchen von Tabakerzeugnissen in Verbindung gebracht werden – eine Gewohnheit, die letztendlich mindestens acht Millionen Menschen pro Jahr tötet. Laut der WHO sind > 40 % aller durch Tabak verursachten Todesfälle auf Lungenerkrankungen wie Krebs, COPD und Tuberkulose zurückzuführen [1]. Während Lungenkrebs eine der weltweit häufigsten Todesursachen ist [2], sind COPD und Asthma vorherrschende Lungenerkrankungen, die extremen Stress hervorrufen, die Lebensqualität einschränken und erhebliche gesellschaftliche Kos­ten verursachen [3].
Atemwegserkrankungen werden häufig erst in ihren späten Stadien diagnostiziert, weil entweder keine spezifischen Symptome vorliegen oder sie mit vorübergehenden virusinduzierten Krankheiten verwechselt werden können. Dies verzögert die Wahrscheinlichkeit einer rechtzeitigen und wirksamen Behandlung. Die Diagnoseverfahren für Asthma bronchiale sowie COPD sind entweder Bronchoskopie, bronchoalveoläre Lavage oder Biopsie. Alle sind sehr invasiv, kostspielig und zeitaufwändig. Folglich ist ein nicht-invasives, schnelles, kostengünstiges und zuverlässiges Screening-Verfahren, das mithilfe robuster und benutzerfreundlicher Analyseplattformen realisiert wird und so die klassischen Methoden zur Diagnose von Asthma bronchiale und COPD ersetzen kann, dringend erforderlich.
Ausatemluft (Atem-Exhalat) kann die perfekte Matrix für diagnostische Untersuchungen sein. Eine Atemprobe ist direkt mit dem betroffenen Organ (z. B. der Lunge) assoziiert und kann daher die emittierten endogenen flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds), die durch oxidativen Stress entstehen, perfekt „sichtbar“ machen. Darüber hinaus akzeptieren Patienten aufgrund ihrer Nicht-Invasivität Atemproben bereitwillig.
Andere biologische Matrices, einschließlich Speichel, Muttermilch, Schweiß, Epithelgewebe, Urin oder Stuhlproben, wurden auf ihre Verwendung bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, zur Beurteilung der chemischen Exposition oder zur Bestimmung des Drogenkonsums untersucht.
Die Diagnostik des Atem-Exhalats wurde im Vergleich zu anderen biologischen Proben intensiver erforscht. Hier sind in der Literatur eine Reihe von Übersichten verfügbar. Keine dieser Übersichten deckt jedoch aktuelle Studien aus den letzten zehn Jahren zu VOCs und Lungenerkrankungen ab.
Aus diversen Gründen hat sich die Hoffnung, durch die Bestimmung von Atem-VOCs eine genauere Diagnostik und therapeutische Erfolgskontrolle bei entzündlichen, allergischen, malignen, degenerativen und durch Umwelteinflüsse bedingten Atemwegs- und Lungenerkrankungen zu erzielen, bis heute kaum erfüllt. In der Übersicht werden die Ansätze für den klinischen Nutzen von VOC-Technologien diskutiert, die zurzeit in wissenschaftlichen Studien verfolgt werden. Der Schwerpunkt liegt auf einer systematischen Darstellung, um so aus aktuellem Wissen über VOC-Atembiomarker für respiratorische Erkrankungen sowie Einzelheiten zu ihrem Potenzial als diagnostische Instrumente nützliche Informationen für zukünftige Studien zu gewinnen.

Asthma bronchiale

Asthma ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die eine reversible Atemwegs­obstruktion hervorruft. Die Erkrankung beginnt häufig in der Kindheit und ist durch das Auslösen von Bronchospasmen gekennzeichnet. Die häufigsten Symptome sind kurze Episoden von Engegefühl im Brustkorb, Husten und Atemnot, wobei diese bei einigen Menschen nachts oder nach anstrengenden körperlichen Übungen stärker ausgeprägt sind [4–6]. Obwohl Asthma aus teilweise unbekannten Gründen auftritt, wird angenommen, dass es häufig durch Umweltverschmutzung, Reizstoffe, Allergene (Pollen, Staub, Fell usw.) oder Medikamente (Aspirin und Betablocker) verursacht wird [7]. Sowohl die Asthma- als auch die COPD-Diagnose basieren auf Symptomen, Lungenkapazitäts- und Spirometrietests, die Folgendes umfassen:

1. FVC (erzwungene Vitalkapazität): das größte Luftvolumen, das gewaltsam ausgeatmet werden kann, und
2. FEV (erzwungenes Ausatmungsvolumen): Wie viel Luft kann in einer Sekunde ausgeatmet werden? [8].

Bei Menschen mit Asthma treten häufig gastroösophagealer Reflux, Eosinophilie, Neutrophilie, allergische Rhinitis, obstruktive Schlafapnoe und Atopie auf [9, 10]. Unter einer Atopie (Triade von Asthma, allergischer Rhinitis und Ekzem) versteht man die Veranlagung, Überempfindlichkeitsreaktionen zu entwickeln und Exazerbationen auszulösen. Eine Exazerbation ist eine Asthmaanfallskrise, die auch bei nicht-atopischen Asthmatikern auftreten kann. Asthma kann nicht geheilt werden; die Vorbeugung umfasst das Vermeiden von Allergenen und Reizstoffen sowie die Verwendung von inhalativen Kortikosteroiden. 2015 wurden weltweit 358 Millionen Menschen mit Asthma bronchiale diagnostiziert, wobei 397.100 Todesfälle auf die Krankheit zurückzuführen waren [2, 3].

Spezifische VOCs

Der Hauptnachteil herkömmlicher Tests zur Diagnose von Asthma bronchiale besteht darin, dass sie zeitaufwändig und zum Teil invasiv sind. Auch nicht-invasive Diagnosetechniken (Spirometrie und fraktioniertes ausgeatmetes Stickoxid) werden verwendet. Die nicht-invasive Diagnose auf der Grundlage von ausgeatmeten VOCs ist vielversprechend und hat daher in letzter Zeit zunehmend an Bedeutung gewonnen. In acht Studien wurde die Asthma­diagnose mittels GC-MS-Analyse getes­tet. Zum Beispiel analysierten Dallinga et al. die Atemproben von 63 asthmatischen Kindern und verglichen sie mit Atemproben von 57 gesunden Kontrollpersonen (Alter: 5 bis 16 Jahre). Es wurde festgestellt, dass nur acht VOCs erforderlich sind, um kranke von gesunden Kindern zu diskriminieren (mit einer korrekten Klassifizierung von 92 %, einer Sensitivität von 89 % und einer Spezifität von 95 %) [5]. In einer weiteren Studie wurde ein Satz von acht Verbindungen verwendet, um zwischen gesunden und asthmatischen Kindern zu unterscheiden. Es wurde jedoch nur eine Verbindung, nämlich 2-Oktenal, als bestimmter Marker für Asthma vorgeschlagen, da die Autoren zu dem Schluss kamen, dass den übrigen möglicherweise andere Ursachen zugrunde liegen [11].
Die Fähigkeit zur Diagnose von allergischem Asthma – manchmal kombiniert mit allergischer Rhinitis bei Kindern – wurde mit HS-SPME/GC-qMS und einer umfassenden zweidimensionalen GC × GC-ToF-MS getestet [12, 13]. Für die Datenverarbeitung verwendete man ähnliche statistische Werkzeuge und die zweidimensionale GC × GC-ToF-MS bewies ihre Überlegenheit im Vergleich zur GC-MS. In der ersten Studie von Caldeira et al. kam ein Satz von 28 VOCs zum Einsatz, um zwischen Asthmatikern und Kontrollgruppen mit einer Klassifizierungsrate von 88 % zu unterscheiden [13]. In ihrer zweiten Studie wurde mit einem Muster von nur sechs Chemikalien, nämlich Nonan, 2,2,4,6,6-Pentamethylheptan, Decan, 3,6-Dimethyldecan, Dodecan und Tetradecan eine Klassifizierungsrate von 98 % erreicht. Die Sensitivität lag bei 96 % (d. h. nur ~ 4 % allergische Asthmakinder wurden als Kontrollen falsch klassifiziert), die Spezifität bei 95 % (d. h. nur ~ 5 % wurden als falsch positiv eingestuft). Alle sechs Chemikalien wurden daher als Biomarker für Asthma vorgeschlagen [12]. In zwei weiteren Studien konnten Exazerbationen bei atopischen Asthmatikern anhand der mittels GC-MS analysierten emittierten VOCs vorhergesagt werden [14, 15]. In der ersten Studie verwendete das angewandte Klassifizierungsmodell sieben VOCs, die eine korrekte Klassifizierungsrate von 91 % für diejenigen Patienten ergaben, bei denen Exazerbationen auftraten (Sensitivität von 79 % und Spezifität von 100 %). Darüber hinaus zeigte die Studie, dass das fraktionierte exhalierte Stickstoffmonoxid (FeNO) und die Lungenfunktion Exazerbationen nicht vorhersagen konnten [14]. Das in der zweiten Studie verwendete Klassifizierungsmodell basierte auf sieben ausgewählten VOCs, drei Aldehyden, einem Kohlenwasserstoff, einem Keton, einer aromatischen Verbindung und einem nicht identifizierten VOC, die eine Sensitivität von 88 % und eine Spezifität von 75 % mit einer AUC von ROC 90 % erreichten [15].
Auch elektronische Nasen wurden bereits zur Unterscheidung zwischen Asthma bronchiale und COPD, Asthma bronchiale und Mukoviszidose sowie zur Asthma bronchiale-Diagnose eingesetzt [16–18].

Chronisch obstruktive Bronchitis

COPD kann mit Asthma koexistieren und tatsächlich als Komplikation von chronischem Asthma auftreten. Im Allgemeinen entwickeln die meisten Menschen mit Asthma nach dem 65. Lebensjahr auch COPD. Obwohl COPD die meisten häufigen Symptome von Asthma aufweist, handelt es sich im Gegensatz zu Asthma um eine fortschreitende Erkrankung, die durch Sputumproduktion und irreversible Atemwegsobstruktion gekennzeichnet ist und sich bei Verwendung von Bronchodilatatoren nicht wesentlich verbessert [19]. Die häufigste Ursache für COPD ist das Rauchen von Tabak [7, 8]. 2015 waren weltweit rund 174 Millionen Menschen von COPD betroffen, und es kam zu 3,2 Millionen Todesfällen [2, 3].

Spezifische VOCs

Die COPD-Diagnose ähnelt derjenigen von Asthma; eine VOC-Analyse ist ebenfalls möglich. COPD wurde mittels GC-MS in sechs Studien untersucht [20–25]. Phillips und Kollegen rekrutierten 119 Patienten mit COPD und 63 Kontrollen für ihre Studie. Es wurden maschinelle Lernansätze verwendet und automatisch Modelle generiert, die die Diagnose bei 64 % der Kontrollen und 79 % der Patienten korrekt vorhersagten und eine AUC von ROC von 0,82 erzielten [20]. Eine bessere Diskriminierung wurde von Van Berkel et al. erzielt, die sechs VOCs verwendeten und so 92 % der Probanden mit einer Sensitivität und Spezifität von 98 bzw. 88 % korrekt klassifizierten. Darüber hinaus wurden 14 von 15 steroid-naiven Patienten korrekt klassifiziert [22]. Es konnte sowohl zwischen COPD und gesunden Kontrollen unterschieden als auch verschiedene COPD-Untergruppen identifiziert werden.  [23]. Trotzdem sind Pizzini und Kollegen näher auf Details eingegangen und es ist in ihrer Studie gelungen, Patienten mit COPD von Patienten mit COPD mit akuten Exazerbationen, d. h. Komplikationen, die durch infektiöse und nicht-infektiöse Agenzien verursacht wurden, abzugrenzen [25].
Es ist allgemein anerkannt, dass Nikotin­abusus zur Entwicklung von Atemwegs­erkrankungen einschließlich COPD führt. Um dies zu untermauern, entwickelten Gaida und Kollegen eine Dual-Center-Studie, um die von Rauchern und Nichtrauchern emittierten VOCs mit denen von Freiwilligen mit oder ohne COPD zu vergleichen [21]. Ihre Ergebnisse zeigten, dass aktive Raucher deutlich von Nichtrauchern unterschieden werden. Durch die Charakterisierung von 134 VOCs konnten sie außerdem 14 VOCs im Zusammenhang mit COPD nachweisen.
Auch Echtzeit-SESI-HRMS (Sekundäre Elektrospray-Ionisation-hochauflösende [High-Resolution] Massenspektrometrie) wurde als Diagnosewerkzeug für COPD verwendet: Hier konnten 1.441 verschiedene VOCs identifiziert werden, von denen aber nur 43 zur Unterscheidung zwischen Gruppen verwendet wurden. Es ergab sich hier eine Genauigkeit von 89 %, eine Sensitivität von 93 % und eine Spezifität von 86 % [26].
Cristescu et al. untersuchten Atemproben von Patienten mit starkem Nikotin­abusus und Emphysem mittels Protonentransferreaktions-Massenspektrometrie (PTR-MS). In der Patientengruppe, bei der das Risiko einer COPD bestand – basierend auf der Hypothese, dass das Emphysem durch eine Entzündung der Atemwege definiert ist – veränderte sich die VOC-Zusammensetzung der ausgeatmeten Luft. Auch wenn die Autoren berichteten, dass die vorgeschlagene Methode beim COPD-/Emphysem-Screening kein wertvolles dia­gnostisches Instrument darstellte, präsentieren sie eine Reihe von VOC-Markern, die mit COPD assoziiert sind [27].
In einer weiteren Studie konnten Patienten mit COPD von Patienten mit COPD plus Bronchialkarzinom (BroCa) mittels Multikapillarsäule (MCC-IMS) und statistischer Auswertemethoden unterschieden werden. Gesunde und COPD-Gruppen wurden mit einer Genauigkeit von 94 % erkannt, während BroCa bei COPD bzw. ohne COPD mit einer Genauigkeit von 79 % klassifiziert wurde [28].
Besa und Kollegen verwendeten auch MCC-IMS, um COPD-Patienten von gesunden Probanden zu unterscheiden. Eine Anzahl von 137 Spektralpeaks erwies sich zwischen der COPD, gesunden Rauchern und Nichtrauchergruppen als statistisch signifikant, während nur sechs VOCs die COPD-Patienten mit einer Genauigkeit von 70 % korrekt von gesunden Kontrollen unterschieden. Darüber hinaus unterschieden 15 Peaks zwischen gesunden Rauchern und gesunden Nichtrauchern [29]. Ein Prototyp eines kompakten GC-IMS mit geschlossenem Gaskreislauf wurde entwickelt und verwendet, um Korrelationen zwischen flüchtigen organischen Substanzen von COPD-Patienten und Kontrollen zu detektieren. In einem zweiten Ansatz verglich man die Ergebnisse der GC-IMS mit Ergebnissen unter Verwendung eines modifizierten Massenspektrometers mit chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck mit GC-Vortrennung (GC-APCI-MS). Im Fall von GC-IMS zeigten drei VOCs signifikante Unterschiede zwischen COPD-Patienten und der gesunden Gruppe, während im Fall von GC-APCI-MS ein charakteristischer VOC, 2-Pentanon, als COPD-spezifischer Marker identifiziert wurde [30].
Mittels ultraschneller Gaschromatografie, die mit einem elektronischen Nasendetektor (FCG eNose) ausgestattet ist, wurden Patienten mit COPD und gesunde Kontrollen untersucht. Mit einem Set von 17 VOCs konnten die Gruppen mit einer Genauigkeit von 82 %, einer Empfindlichkeit von 96 % und Spezifität von 91 % korrekt klassifiziert werden [31]. Hattesohl und Kollegen verwendeten ein Cyranose 320 eNose-Instrument, um die VOC-Mus­ter von COPD-Patienten mit und ohne Alpha-1-Antitrypsin(AAT)-Mangel zu messen [32]. Die Autoren konnten beweisen, dass ein E-Nasen-System VOCs von COPD-Patienten mit AAT-Mangel unterscheiden kann. Es erhält einen Kreuzvalidierungswert von 82 % (mit einer Sensitivität sowie einer Spezifität von 100 %), wenn AAT-Atemkondensate ausgeatmet werden. AAT-Mangel- und COPD-Gruppen wurden verglichen. Im reinen ausgeatmeten Atem war der Kreuzvalidierungswert niedriger und betrug nur 58,3 % (mit einer Sensitivität und einer Spezifität von je 100 %).

Unterscheidung zwischen Asthma und COPD

Für beide Lungenerkrankungen wurden zahlreiche Biomarker gemeldet, die in Tab. 1 zusammengefasst sind.

Die statistische Auswertung dieser VOCs von Asthma bronchiale sowie COPD ermöglicht eine Diskriminierung zwischen Asthma bronchiale und COPD mit > 90 % Varianz [33].

VOC-Marker

Kohlenwasserstoffe sind stabile Endprodukte der Lipidperoxidation, die in Echtzeit (Sekunden) nach der Bildung in Geweben im Atem freigesetzt werden [34]. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von Alkanen (Ethan und Pentan) im Atem-Exhalat mit der Lipidperoxidation korreliert [35]. Pentan ist jedoch auch ein unspezifischer Marker, über den im Kontext von Darmerkrankungen [36] und rheumatoider Arthritis [37] diskutiert wird.
Aldehyde sind mit oxidativem Stress und entzündlichen Prozessen assoziiert [4]. Hexanal, Heptanal und Nonanal, die durch Peroxidation von Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren gebildet werden [38], wurden als Marker für Asthma und COPD beschrieben [15, 24, 29–41]. In Zigarettenrauch vorkommende endogene Verbindungen (wie Acetonitril, Furan, 2-Methylfuran, 3-Methylfuran, 2,5-Dimethylfuran, Benzol und Toluol) werden in Atemproben von Rauchern nachgewiesen, jedoch nicht im Atem von Nicht- oder Ex-Rauchern [42, 43].
In einer Pilotstudie identifizierten Gahleitner und Kollegen VOC-Marker für pädiatrische Asthma-Patienten im Atem-Exhalat. Nach einer partiellen Diskriminierungsanalyse der kleinsten Quadrate wurden acht Verbindungen (1,7-Dimethylnapthalin; 1-(Methylsulfanyl)propan; 2-Octenal; Octadecyn; 1-Isopropyl-3-methylbenzol; Ethylbenzol; 1,4-Dichlorbenzol und Limonen) untersucht. Sie leisten den größten Beitrag zur Unterscheidung zwischen Asthmatikern und Kontrollgruppen. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass nur 2-Octenal einen endogenen Marker darstellte [11].

Limitationen

Die Diagnose einer Lungenerkrankung über Atemproben wird in der Praxis noch nicht angewendet. Dies lässt sich durch eine Reihe von Einschränkungen und Herausforderungen wie Probenahme, Analyse, Störfaktoren, korrekte Verwendung von Kontrollen, geringe Anzahl von Kontrollprobanden, Ernährungsprobleme, Medikamente, medizinische Behandlungen, gleichzeitig bestehende Erkrankungen und mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Studien erklären.
In Bezug auf die Probenahme ist gut dokumentiert, dass die Probanden mit unterschiedlichen Frequenzen spontan atmen. Hypo- oder Hyperaktivität während der Probenahme führt zu Änderungen in der Zusammensetzung der abgelaufenen Atmung. Die Konzentrationen im Atem-Exhalat nehmen in der Endphase der Ausatmung dramatisch zu, die mit der höchsten Konzentration an Kohlendioxid korreliert [34]. Folglich sollte die Standardisierung von dieser Ebene ausgehen.
Die Ruhezeit vor der Probenahme und die Festlegung, welche Fraktion des Atems beprobt werden soll, müssen definiert werden. In Bezug auf Analysen ist eine Kombination von GC-MS-Instrumenten, die zur VOC-Detektion verwendet werden sollen, gefolgt von einer schnellen Identifizierung dieser Biomarker mit schnellen Techniken wie IMS, Sensoren oder elektronischen Nasen äußerst wünschenswert.
In einigen Studien sind die Kontrollkohorten im Vergleich zu den untersuchten Patientengruppen jünger. Es ist jedoch noch fraglich, inwieweit die Variablen wie Alter, Raucherstatus, Body-Mass-Index und Vorhandensein anderer Krankheiten die emittierten VOC-Profile im Atem-Exhalat beeinflussen können. Es ist zu bedenken, dass eine strenge Quantifizierung der VOCs aufgrund von Unterschieden bei den Patienten, die hauptsächlich auf Geschlecht und Alter zurückzuführen sind, nahezu unmöglich ist. Erwachsene Männer mit größerem Brustvolumen atmen definitiv mehr aus als Frauen, ältere Menschen oder Säuglinge. Ob die Konzentration der zielführenden VOC-Marker vom Gesamtvolumen beeinflusst wird, bleibt weiterhin umstritten.
Die geringe Kohortengröße in vielen Studien ist eine weitere Einschränkung, die hier erwähnt werden muss. Viele der klinischen Studien umfassten nur ein paar Dutzend Freiwillige [12, 26, 44, 45] und selten mehr als zweihundert Patienten [20, 43, 46]. Darüber hinaus kommen die Patienten von einem begrenzten Ort. Geo­grafische Unterschiede in den ausgeatmeten VOCs wurden auch zwischen zwei Probenahmestellen in China und Lettland festgestellt [33, 47].
Die Ernährung ist ein weiterer wichtiger Faktor im Zusammenhang mit der Analyse von VOCs im Atem-Exhalat. In vielen Studien wurden Fastengrenzen von einer Stunde [17, 48, 49], zwei Stunden [10, 16, 23, 50], drei Stunden [11, 25], vier Stunden [20] und sechs Stunden [51] festgelegt. In einigen Studien fasteten die Freiwilligen über Nacht oder 12 Stunden [52–55]. Eine lange Fastenzeit wird jedoch nicht leicht akzeptiert und ist in einem realen Szenario nicht möglich [33].

Zukunftsperspektiven

Die derzeit verfügbaren Instrumente zur Diagnose von Lungenerkrankungen auf der Grundlage von ausgeatmeten VOCs sind vielversprechend, aber bei weitem noch nicht von klinischem Nutzen. Dennoch sind sowohl die Unterscheidung zwischen Asthma bronchiale und COPD als auch die Diagnosevorhersage relevant. Bevor die Analyse spezifischer VOCs in der klinischen Praxis umfassend angewendet werden kann, müssen jedoch mehrere Herausforderungen – einschließlich Probenahme, Analyse, Validierung und Standardisierung – gelöst werden. In Abwesenheit eines „qualitätssichernden“ Atemreferenzmaterials sollten routinemäßige Atemkontrollmessungen zu bestimmten Zeiträumen durchgeführt werden. Auch die Hintergrundluft, die sich auf die Leistung der Methoden auswirken kann, muss überwacht werden. Der Datenverarbeitungs-Workflow sollte ebenfalls standardisiert werden, inkl. Ausrichtung der Peaks, Normalisierung und statistischer Analysen. Zudem ist die Erstellung von Marker-Datenbanken mit standardisierten Methoden, auf die Forscher zugreifen und die sie vervollständigen können, immens wichtig. In Bezug auf langfristige Zukunftsperspektiven stellen Online-Instrumente, insbesondere portable Instrumente, IMS, GC-IMS, und Sensoren, anwenderfreundliche Geräte für Ärzte sowie Patienten dar, die sowohl bei der Diagnose als auch bei Überwachung von Atemwegserkrankungen eingesetzt werden können.