T-Zellen nach Maß

Zelltherapie: ein altes, erfolgreiches Konzept

Zellen, Gewebe und Organe werden schon seit geraumer Zeit als lebende Therapeutika eingesetzt. So mildern Ery­throzyten und Blutplättchen regelmäßig Leid und retten manches Leben. Auch Knochenmark und angereicherte hämatopoetische Stammzellen (HSZ) werden heute routinemäßig transplantiert, wobei die Zellen hauptsächlich unverändert transplantiert werden. Es gibt nur vereinzelt Berichte von Zellen, die vor einer Transplantation genetisch manipuliert wurden. So wurden beispielsweise um die Jahrtausendwende HSZ von Patienten mit severe combined immunodeficiency syndrome (SCID) viral mit einem Wildtyp-Transgen transduziert, um einen zugrunde liegenden Gendefekt zu beheben. Die genetisch veränderten HSZ wurden anschließend transplantiert, was in der Tat zu einer permanenten Heilung führte [1]. Diese Resultate zeigen das enorme Potenzial von Gen- und Zelltherapien. Leider entwickelten jedoch mehrere der behandelten Patienten sekundär eine akute Leukämie und einer der Patienten starb [2]. Diese Extreme zeigen, dass manche genetische Krankheiten geheilt werden können, zeigen aber auch mögliche Gefahren auf.

Technik des Einbringens der Transgene limitiert breitere Anwendung

Die meisten Techniken, mit denen eukaryotische Zellen permanent genetisch verändert werden können, beruhten bis vor Kurzem auf einer viralen Transduktion der Zielzelle. Retro- oder Lentiviren, die Säugerzellen infizieren und ihr Genom in das Säugergenom einbauen können, wurden biotechnologisch so angepasst, dass sie sich nach dem Einbau im Genom nicht weiter replizieren können. Dies verhindert eine unkontrollierte Vermehrung der Viren, die als Vektoren dienen. Bisher war es aber nicht möglich, zu steuern, wo ein bestimmtes Transgen ins Genom eingebaut wird. Die Integration der Transgene erfolgt also zufällig. Das Zufallsprinzip birgt jedoch Gefahren, z. B. wenn ein Transgen in ein Tumorsuppressorgen integriert und dieses dadurch zerstört. Deshalb sollte zufällige Genomintegration für therapeutische Zwecke nach Möglichkeit verhindert werden [3]. Bei den von Leukämie betroffenen SCID-Patienten stellte sich heraus, dass die viralen Promotoren Onkogene der Wirtszellen aktivierten. Neuere Generationen viraler Vektoren sind nun zwar sicherer, die Integration kann aber weiterhin nicht gesteuert werden, wodurch eine potenzielle Gefahr bestehen bleibt. Dieser Prozess ist für hämatopoetische Zellen, v. a. Immunzellen, speziell gefährlich, da sich diese tausendfach vermehren können. Eine Risikoabschätzung zwischen Grunderkrankung und möglicher Therapiekomplikationen ist deshalb zwingend.
Eine weitere Limitierung viraler Vektoren ist die beschränkte Größe der Transgene, die mittels viralem Vektor in eine Zelle eingebracht werden können. Es ist zwar möglich, einzelne Gene einzubringen, eine Kombination mehrerer Gene kann jedoch schwierig oder unmöglich sein.

CAR-T: ein revolutionäres Konzept

In den späten 1980er-Jahren entwickelte die Gruppe um Zelig Eshhar ein revolutionäres Konzept, um die Spezifität der T-Zellrezeptoren (TZR) umzuprogrammieren. T-Zellen exprimieren hochspezifische TZR, erkennen das zugehörige Antigen aber nur im Kontext von HLA-Molekülen, die auf körpereigenen Zellen exprimiert sind. Da HLA-Moleküle interindividuell sehr unterschiedlich sind, können T-Zellen für therapeutische Zwecke nicht ohne weiteres von einem Spender auf einen Empfänger übertragen werden. Um eine hohe, definierte Spezifität zu programmieren und gleichzeitig von HLA unabhängig zu werden, kombinierten die Forscher die variablen, antigen-erkennenden Regionen eines Antikörpers mit denjenigen TZR-Teilen, die für die Signalübertragung in der T-Zelle notwendig sind. Der Trick liegt darin, dass Antikörper Oberflächenproteine ohne HLA-Restriktion erkennen. Erstaunlicherweise funktionieren solche chimären Rezeptoren tatsächlich. Da sie chimär aus einem B-Zellrezeptoranteil (Antikörper) und TZR zusammengesetzt sind, werden sie chimäre Antigen-Rezeptoren (CAR) genannt. Eine ausführliche Besprechung wurde kürzlich in diesem Journal publiziert [4]. CAR T-Zelltherapien führten zu nie dagewesenen klinischen Erfolgen bei Patienten mit CD19-positiven B-Zelltumoren [5, 6]. Da das Prinzip nun klinisch mehrfach nachgewiesen und die CAR-Therapie zur Behandlung von B-Zell-Lymphomen kürzlich zugelassen wurde [7], werden in über 200 klinischen Studien weitere Anwendungen getestet.

Limitierungen von CAR-T-Zellen

Damit diese neue Therapieform für viele Patienten mit diversen Krankheiten sicher und ökonomisch skaliert werden kann, müssen noch große Hürden übersprungen werden. Bis heute sind zwei CAR-T-Produkte als kommerzielle Therapeutika von den regulatorischen Behörden zugelassen. Diese werden jeweils für einzelne Patienten maßgeschneidert. T-Zel­len des Patienten werden entnommen. In diese werden dann ex vivo mittels viraler Transduktion die CARs eingebracht. Anschließend werden die umprogrammierten CAR-T-Killerzellen als therapeutisches, körpereigenes Produkt in den Körper zurückgeführt. Wie oben erwähnt, wäre es wünschenswert, wenn die virale Transduktion durch gezielte Insertion in einen bestimmten, sicheren Genom-Lokus ersetzt werden könnte. Zudem wäre es sinnvoll, vorgefertigte, allogene CAR-T-Zellen anzuwenden. Aktuell dauert es mehrere Wochen, bis ein CAR-T-Produkt ex vivo hergestellt ist. Schon vorgefertigte CAR-T-Produkte wären schneller verfügbar, was insbesondere bei aggressiven Krebsformen ein Vorteil wäre. Dieses Verfahren wäre auch günstiger, da von einem Spender Zellprodukte für mehrere Empfänger hergestellt werden könnten. Hierfür gilt es allerdings immunologische Hürden zu eliminieren. Einerseits können die CAR-T-Zellen im Empfänger Schaden anrichten, wenn ihr endogener T-Zellrezeptor nicht ausgeschaltet wird. Andererseits können die allogenen CAR-T-Zellen vom Empfänger abgestoßen werden. Zudem sollte die CAR T-Zell-Aktivität nach dem Transfer in den Empfänger kontrollierbar sein, um On- oder Off-target-Nebenwirkungen zu behandeln. Wünschenswert wäre auch eine Programmierbarkeit der Wanderung in vordefinierte Körpernischen, z. B. in spezifische Tumoren, sowie die Programmierbarkeit von Effektorfunktionen, wie z. B. der Zytokinsekretion. Nicht-hämatologische Tumoren bilden lokal ein immunsuppressives Milieu. Deshalb stellte sich die Adaptation des CAR-T-Zell-Konzeptes für solide Tumoren als speziell schwierig heraus. Entsprechend wären auch hierfür programmierbare Strategien erwünscht, welche die CAR-T-Zellen gegen die tumorinduzierte Immunsuppression resistent machen.

Genome Engineering  vereinfacht Programmierbarkeit von T-Zellen

Das gezielte Verändern des Genoms (Genome Engineering) in Säugerzellen ist seit Jahren möglich, war aber bisher äußerst aufwendig. Die Entdeckung und Entwicklung der CRISPR/Cas-Systeme als biotechnologische Werkzeuge hat dies schlagartig verändert [3]. Der große Vorteil der CRISPR/Cas-Systeme liegt darin, dass für den DNA-Schnitt immer das gleiche Enzym (eine Endonuklease) verwendet werden kann. Die am häufigsten verwendete Endonuklease wird Cas9 genannt, es sind aber viele Varianten bekannt. Der Ort des Schnitts wird durch eine spezifische RNA, die sogenannte guide-RNA (gRNA), bestimmt, die synthetisch einfach herzustellen ist. Mittels Computer-Algorithmen kann auf einfache Art eine passende gRNA entworfen und auch gleich über entsprechende kommerzielle Webseiten bestellt werden. Für technische Details möchte ich auf einen kürzlich erschienenen Artikel hinweisen ([8] und Zündorf & Dingermann, hier lesen).
Aufgrund der Einfachheit der CRISPR/Cas-Systeme versuchten wir eine Herangehensweise zu entwickeln, um mittels CRISPR/Cas9 primäre T-Zellen von Mäusen genetisch zu verändern [9]. Wir erforschen komplexe genetische Netzwerke, die in T-Zellen von mikroRNAs kontrolliert werden. Unsere Werkzeuge wurden jedoch den Anforderungen moderner mikroRNA-Forschung nicht gerecht. Unser Ziel ist es, in einzelnen T-Zellen gleichzeitig mehrere Gene gezielt zu mutieren. Dies ist mit herkömmlichen Methoden nicht bzw. nur sehr langsam möglich. Bisher brauchte es einige Jahre, um das Genom einer Maus gezielt zu verändern. Im Gegensatz dazu können CRISPR/Cas-Mutationen innerhalb von Tagen gesetzt werden. Wir begannen, Oberflächenproteine in T-Zelllinien auszuschalten. Wir wollten ein virusfreies System entwickeln, das uns maximale Flexibilität geben sollte. Da CRISPR/Cas das Genom permanent verändert, bleiben die Mutationen bestehen. Deshalb reicht eine vorübergehende Anwesenheit der Gen-Editierungs-Werkzeuge, um langfristige Effekte zu erzielen. Cas9 und die gRNA müssen nicht permanent als Transgen eingebracht werden. Wir testeten viele verschiedene Methoden, CRISPR-Werkzeuge in die T-Zellen einzuschleusen und entschlossen uns schließlich für eine Elektroporationsmethode. In ersten Tests funktionierten Plasmide gut, mit kommerziellem rekombinantem Cas9 oder Cas9-mRNA waren wir hingegen nicht erfolgreich. In der Zwischenzeit bietet rekombinantes Cas9 jedoch je nach Anwendung eine attraktive Alternative. Wir konnten bald auch Oberflächenproteine und sogar zwei Gene gleichzeitig in primären T-Zellen mit hoher Effizienz ausschalten. Wichtig ist, dass die editierten T-Zellen nach einer kurzen, 2-tätigen Phase ex vivo wieder in Empfängermäuse transferiert werden können, in denen sie sich größtenteils verhalten wie genetisch unveränderte T-Zellen.
Die transferierten Zellen überleben, wandern in sekundäre lymphoide Organe und verhalten sich nach viraler Infektion der Empfängermäuse wie erwartet. Wir konnten zeigen, dass eine CRISPR/Cas-induzierte Deletion von ICOS dazu führt, dass weniger follikuläre T-Zellen entstehen. Wir konnten damit zeigen, dass sich die mit unserem Protokoll editierten T-Zel­len verhalten, wie das von konventionell hergestellten ICOS-defizienten T-Zel­len, d. h. T-Zellen von ICOS-defizienten Mäusen, bekannt ist. Diese Resultate legen nahe, dass die CRISPR-basierte Genom-Editierung in T-Zellen für gewisse Fragestellungen den konventionellen Methoden, um Gene in Mäusen auszuschalten, ebenbürtig ist. Da die Methode aber viel günstiger und schneller ist, können mit weniger Aufwand mehrere Kandidatengene rasch getestet werden. Für die interessantesten Gene kann dann in einem zweiten Schritt eine Maus mit einer klassischen genomischen oder konditionellen Mutation etabliert werden.
Als nächstes optimierten wir die Methode, um gezielt Punktmutationen in T-Zellen einzubringen und konnten damit in kurzer Zeit ein B-Zell-Epitop in primären Zellen bestimmen. Schließlich verwendeten wir die Methode, um eine krankmachende Genmutation zu korrigieren. Wir wählten dazu eine Mutation im Foxp3-Gen, die bei einem Patienten mit dem Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom auftrat. Der Transkriptionsfaktor Foxp3 ist für regulatorische T-Zellen (Treg) essenziell, weshalb Foxp3-Mutationen zu einer gestörten Immunregulation und dadurch zu einem Syndrom mit multiplen, schweren Organschäden führen kann. Vor Jahren wurde die entsprechende Patientenmutation ins Genom von Mäusen eingebracht, um ein Mausmodell dieser monogenen Erkrankung zu schaffen [10]. Wir entnahmen den kranken Mäusen T-Zellen, reparierten den Gendefekt und konnten zeigen, dass dadurch Foxp3 wieder exprimiert werden kann. Im Gegensatz zu den eingangs erwähnten SCID-Patienten, bei denen die mutierten Gene durch Wildtyp-Transgene ersetzt werden, erlauben Genom Editierungs-Techniken eine direkte, kausale Korrektur krankmachender Gene.
Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass es möglich ist, das Genom in primären T-Zellen virusfrei effizient und gezielt zu verändern. Dies ist für Forschungsprojekte von Interesse, um präzis regulatorische genetische Elemente auszuschalten und deren Funktion zu erkunden. Da T-Zellen derzeit große therapeutische Erfolge erzielen, ist aber auch eine Translation zu humanen T-Zel­len von großem Interesse.

Translation in das humane T-Zell-Gebiet

Die Translation der CRISPR/Cas-Methode auf humane T-Zellen und hämatopoetische Stammzellen ist bereits weit fortgeschritten. Kollegen aus den USA entwickelten eine effiziente Methode, mittels Elektroporation rekombinantes Cas9 und guide-RNA in humane T-Zel­len einzubringen [11]. Damit können effizient Gene ausgeschaltet werden. Weiterhin gelang es auch, gezielte Mutationen einzubringen. Bisher konnten T-Zellen aber nur nach Aktivierung genetisch verändert werden. Vor Kurzem wurde nun aber eine weitere Methode publiziert, mit der auch naive T-Zellen von Mäusen und Menschen ohne Voraktivierung verändert werden können [12]. Dies ermöglicht u. a. die Untersuchung der Funktion eines Genes während der T-Zellaktivierung. Schließlich konnte die Methode weiterentwickelt werden, sodass nun in humanen T-Zellen auch ganze Genmodule gezielt ins Genom eingeschleust werden können. Die Gruppe um Alexander Marson konnte kürzlich erfolgreich in humanen T-Zellen den endogenen TZR durch einen tumorspezifischen TZR ersetzen [13]. Durch diese rasante methodische Entwicklung kommen wir der erwünschten virusfreien T-Zell Programmierbarkeit über das Ausschalten oder Anschalten eines oder mehrerer Gene und somit der gezielten Programmierung genetischer Schaltkreise in humanen T-Zel­len bereits sehr nahe. In Anlehnung an Computer-Programmierung wird solches biologisches Programmieren auch als genome hacking umschrieben.
Erfreulicherweise sind humane T-Zel­len verhältnismäßig gut in vitro expandierbar. Dies erleichtert es, die Machbarkeit, den Nutzen und die Sicherheit programmierbarer T-Zelltherapien in klinischen Studien zu erforschen. Erste Studien wurden bereits lanciert, Protokolle mit weit komplexeren Veränderungen werden sicherlich folgen.