Liquid Biopsy: Transport, Stabilisierung und Analytik
Die Liquid Biopsy ist eine minimalinvasive Methode, deren Einsatz den untersuchten Personen eine Gewebebiopsie ersparen kann. Körperflüssigkeiten müssen hierfür bei Zimmertemperatur schonend transportiert werden. Dabei werden auch die in der Probe vorhandenen frei zirkulierenden Nukleinsäuren (DNA und RNA), Zellen oder auch Proteine für sich anschließende Analysen durch entsprechende Zusätze stabilisiert. Bei Letzteren handelt es sich derzeit hauptsächlich um molekularbiologische Methoden wie die quantitative Digital Droplet PCR (ddPCR) und das Next Generation Sequencing (NGS) zur Charakterisierung von zirkulierender Tumor-DNA oder -RNA (ctDNA/RNA) aus dem Blut. Genauso können aber auch andere Körperflüssigkeiten wie Liquor, Pleuraerguss, Speichel, verflüssigte Stuhlproben oder Urin für die Untersuchung von ctDNA/RNA herangezogen werden [2]. Die zirkulierenden Tumor-Nukleinsäuren geben Auskunft über den Mutationsstatus des Tumors, der wiederum Rückschlüsse auf die Krankheitsaktivität der Tumorerkrankung zulässt.
Probenmaterial Blutplasma
Der Nachweis von Mutationen aus zirkulierender Tumor-DNA oder auch aus Tumorzellen lässt prognostische Aussagen zum Krankheitsverlauf sowie zur Therapiekontrolle bei onkologischen Patient:innen zu – beispielsweise über die Bestimmung der MRD-Rate (MRD = „minimal residual disease“). Blutplasma wird verwendet, um zellfreie Nukleinsäuren im Blutstrom nachzuweisen. Serum eignet sich als Untersuchungsmaterial weniger, da während des Gerinnungsprozesses DNA aus den Immunzellen zur Kontamination der ctDNA-Fraktion [1, 2] führen kann. Um den geringen Anteil an ctDNA nicht bereits bei der Probengewinnung zu zerstören, sollten unbedingt eine Nadel mit großem Durchmesser (≤ 21 G) und ein zellstabilisierendes Probenröhrchen (s. S. 202 unten) verwendet werden. Das Plasma kann aus diesem Blutröhrchen dann innerhalb von zwei bis sieben Tagen bei einer Temperatur zwischen 10 und 30 °C entnommen werden. Je nach Ziel der Untersuchung sind unterschiedliche Probenvolumina gefordert. Die Bestimmung der MRD benötigt bis zu 60 ml Probenvolumen, während für das Therapiemonitoring im metastasierten Zustand in der Regel nur 5 bis 10 ml Blut erforderlich sind [1].
Digital Droplet PCR und Next Generation Sequencing
Die ddPCR und das NGS können eingesetzt werden, um die aus der Liquid Biopsy gewonnene ctDNA zu analysieren. Beide Methoden sind hochsensitiv und erlauben eine absolute Quantifizierung ohne Standards. Für die ddPCR wird die Probe vor der eigentlichen PCR in zahlreiche Droplets (Partitionen) unterteilt, die einzeln analysiert werden. Eine Partition enthält nur noch eine geringe Anzahl an Zielmolekülen: im Idealfall eines, maximal zwei oder auch keines. Aus den einzelnen Partitionen erfolgt eine Endpunkt-PCR mit fluoreszenzmarkierten Sonden zur gezielten Vervielfältigung bekannter Sequenzen. Das bedeutet, dass auf bereits bekannte Hotspot-Mutationen z. B. in den Genen KRAS, BRAF, EGFR, PIKC3A und ESR1 geprüft wird. Für diese gibt es kommerzielle Testkits.
Die Bestimmung der MRD für den Tumor eines Betroffenen beginnt mit der Analyse des Tumors mittels WGS (WGS = Whole Genome Sequencing). Um die MRD zu bestimmen oder zur Therapiekontrolle wird dann ein individueller, auf die mutierten Gene maßgeschneiderter NGS-Assay entwickelt (vorkonfektionierte Testkits).
Kontroll- und Referenzmaterialien
Angesichts des niedrigen Limit of Detection (LOD) müssen beide Methoden sorgfältig überwacht werden. Standardreferenzmaterialien (RM) sind für die präzise und zuverlässige Erstellung von ctDNA-Profilen unverzichtbar. Sie dienen als Benchmarks zur Bewertung der Assay-Leistung, indem sie bekannte ctDNA-Varianten und -Konzentrationen mit den Sollwerten abgleichen, wodurch Genauigkeit, Präzision und die Validierung von Methoden sichergestellt werden [1]. Darüber hinaus ermöglichen RMs die kontinuierliche Überwachung der Assay-Performance und -Genauigkeit in klinischen Routineuntersuchungen, was konsistente und verlässliche Patientenergebnisse gewährleistet. RM spielen zudem eine entscheidende Rolle in Ringversuchen und Eignungsprüfungen, da sie die Konsistenz zwischen verschiedenen Laboren fördern und zur Standardisierung der Arbeitsabläufe beitragen.
Grundsätzlich ist eine sorgfältige Dokumentation aller präanalytischen und analytischen Schritte zwingend erforderlich. ctDNA wird hauptsächlich durch automatisierte Kapillarelektrophorese auf Kontaminationen durch genomische DNA überwacht. Zu diesem Zweck werden Größenprofile der cfDNA erstellt.
Dr. Gabriele Egert, Mitglied der Redaktion
Dr. Abel Bronkhorst, Deutsches Herzzentrum München
Zellbiologisches Forschungslabor,
bronkhorst[at]dhm.mhn[dot]de
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