Molekulare Blutgruppen - Auf den Punkt gebracht

Derzeit sind 38 Blutgruppensysteme von der International Society of Blood Transfusion (ISBT) anerkannt, denen Polymorphismen in 45 Genen zugrunde liegen. Die meisten dieser Polymorphismen basieren auf Punktmutationen, die zu neuen Antigenen oder dem Fehlen von Antigenen führen. In der Diagnostik kommen bewährte Verfahren, wie die PCR-SSP, und neuere Verfahren, wie das Next Generation Sequencing, zum Einsatz.

Schlüsselwörter: ISBT, Nomenklatur, Phänotyp, Genotyp, RT-PCR, Chip-PCR, Bead-basierte PCR, MALDI-TOF-MS, NGS

Auf der Zellmembran von Erythrozyten finden sich zahlreiche polymorphe Oberflächen- und Transmembranproteine. Sie tragen die verschiedenen Blutgruppen-Antigene, welche häufig Glykoproteine sind. Ihre Spezifität ist meist in Oligosacchariden (wie beim AB0-System) oder in der Aminosäuresequenz (z. B. bei Kell) begründet. Jede Blutgruppe repräsentiert entweder ein einzelnes Gen oder mehrere gekoppelte homologe Gene.
Von der International Society of Blood Transfusion (ISBT) sind derzeit über 600 Antigene anerkannt, die den 38 Blutgruppensystemen zugeordnet und von 45 Genen kodiert werden.
Für die Anerkennung einer Blutgruppe durch die ISBT müssen die folgenden fünf Bedingungen erfüllt sein:

Sie weisen mindestens ein Antigen auf, für das ein natürlicher Antikörper bekannt ist.
Das betreffende Antigen wird nachweislich vererbt.
Das entsprechende Gen und der für das Antigen ursächliche Polymorphismus sind bekannt und wurden sequenziert.
Der Genort ist bekannt.
Das entsprechende Gen unterscheidet sich eindeutig von allen bisher anerkannten Genen und ist nicht homolog zu diesen.

Neben den oben genannten 38 Blutgruppensystemen existiert eine Reihe weiterer Antigene, die diese Bedingungen nicht gänzlich erfüllen und in den sogenannten „Series“ zusammengefasst werden.

Nomenklatur

Jedes Antigen wird mit einer sechsstelligen Nummer bezeichnet. Die ersten drei Ziffern repräsentieren das Blutgruppensystem (z. B. 006 für Kell bzw. 008 für Duffy), die letzten drei Ziffern die Spezifität (z. B. 006003 für Kp^a bzw. 008001 für Fy^a). Alternativ kann auch das Symbol für das Blutgruppensystem zusammen mit der Antigennummer verwendet werden – vorangestellte Nummern können hierbei entfallen (z. B. KEL003 bzw. KEL3 und Fy001 bzw. Fy1).
Phänotypen werden durch das Symbol für das Blutgruppensystem gekennzeichnet; nach einem Doppelpunkt folgt eine durch Kommas getrennte Liste der Antigene. Fehlende Antigene werden durch ein vorangestelltes Minuszeichen gekennzeichnet (z. B. KEL: -1, 2, 3, 4 bzw. Fy: -1, -2). Da die Nutzung der numerischen Bezeichnung im alltäglichen Gebrauch nicht praktikabel ist, verwendet man hier oft Alternativnamen (z. B. beschreiben KEL K-/k+, Kp(a+b+)¹ und Fy(a-b-) die oben genannten numerischen Phänotypen).
Für Allele und Genotypen ist generell Kursivschreibung gebräuchlich, wobei Allele durch das Symbol für das Blutgruppensystem, gefolgt von einem Stern und der Antigennummer gekennzeichet sind (z. B. KEL*02). Genotypen werden durch Nennung der beiden elterlichen Allele, getrennt durch einen Schrägstrich, dargestellt (z. B. KEL*02.03/02) [1].

Historie

Xg (ISBT 012, Symbol XG) war die erste Blutgruppe, für die 1983 ein Zusammenhang zwischen einer individuellen genetischen Veranlagung und einem Blutgruppen-Phänotyp hergestellt werden konnte [2]. Drei Jahre später wurden genetische Varianten der Blutgruppensysteme Gerbich (ISBT 020, GE) und MNS (ISBT 002, MNS) beschrieben [3, 4].

Im Jahre 2010 stellten Geoff Daniels und Marion Reed die bis dahin bekannten Blutgruppensysteme – unter ihnen die bedeutenden Systeme AB0 (ISBT 001, AB0), Rhesus (ISBT 004, RH) und Kell (ISBT 006, KEL) sowie Duffy (ISBT 008, FY) und Kidd (ISBT 009, JK) – zusammengefasst dar. Zeitgleich wurde Rhesus-Associated Glycoprotein (RHAG) als ISBT 030 anerkannt [5, 6].
Von 2012 bis 2015 folgten dann die genetischen Beschreibungen der Blutgruppensysteme JR (ISBT 032, JR), Langereis (ISBT 033, LAN) und Vel (ISBT 034, VEL) jeweils gleichzeitig durch verschiedene Forschergruppen [7–13]. Im selben Zeitraum wurden auch die sehr seltenen Phänotypen der Blutgruppen Forssmann (ISBT 031, FORS), CD59 (ISBT 035, CD59) und Augustine (ISBT 036, AUG) [14–17] beschrieben [18].
Zuletzt wurden von der ISBT im Jahr 2019 die beiden Blutgruppensysteme KANNO (ISBT 37, KANNO) mit einer Punktmutation auf dem PRNP-Gen auf dem Chromosom 20 [19] und dem Antigen KANNO1 sowie Sid (ISBT 38, SID) mit dem Kandidatengen B4GALNT2 und dem Antigen Sda [20] anerkannt.

Polymorphismen

Tab. 1 gibt einen Überblick über die Arten und die jeweilige Anzahl der Polymorphismen, die bestimmte Antigene – oder ihr Fehlen – bei den Blutgruppen Lutheran, Kell und RhD verursachen.

Tab. 1: Punktmutationen (SNV), die Antigene und deren Fehlen bei den Blutgruppensystemen Lutheran (Gen BCAM), Kell (Gen KEL) und RhD (Gen RHD, gesplittet nach Untergruppen) verursachen. AG = Antigen, As = Aminosäure, ad/el = Adsorption/Elution, in/del = Insertion/Deletion. Die Daten stammen aus den Allel-Tabellen der ISBT-Versionen 3.0 160630 (BCAM) und 2.0 110914 (KEL, RHD) vom November 2016 [1]. Tabelle nach [18].

Bei genauerer Betrachtung wird schnell klar: Punktmutationen, früher Single-Nucleotide-Polymorphism (SNP) genannt und heute besser mit Single-Nucleotide-Variant (SNV) bezeichnet, kodieren für 79 % aller Blutgruppenvarianten. Zwei Sequenzen unterscheiden sich also nur in einer einzigen Base voneinander. Die SNVs haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Antigene: Missense-Mutationen führen dazu, dass eine andere Aminosäure in das Protein eingebaut wird. So entstehen z. B. neue Antigene oder „weak“-Antigene; auch fehlende Antigene können so verursacht werden. Bei Splice-Site-Mutationen werden die Intron-Exon-Übergänge so stark modifiziert, dass das Splicing gestört wird und Exons oder Introns verloren gehen und die Proteinstruktur verändert wird (neue oder fehlende Antigene). Mutationen in der Promotor-Region haben möglicherweise zur Folge, dass die Transkriptionsfaktoren nicht mit der DNA in Wechselwirkung treten können und eine Transkription durch die RNA-Polymerase nicht stattfinden kann. Frameshift-Mutationen (Insertion oder Deletion von Basenpaaren) führen zu einer Veränderung des Leserasters und in den meisten Fällen zu einem vorzeitigen Kettenabbruch während der Translation und zu einem verkürzten Protein.
Die restlichen 21 % der Varianten, die nicht in der Tabelle aufgeführt sind, entstehen entweder durch Substitution bzw. Deletion von zwei Basenpaaren (3 %) oder durch Allel-Mischformen (sog. Hybride) der Gene RHD und RHCE in der Blutgruppe RhD (18 %). Hier haben die beiden paralogen Gene aufgrund ihrer Ähnlichkeit (Homologie) mehrere Genbereiche untereinander ausgetauscht [18].
Wenn man den vorhergehenden Abschnitt betrachtet, könnte man meinen, dass sich Blutgruppen-Antigene durch Mutationen häufig verändern. In Wirklichkeit sind die verschiedenen Allele relativ konserviert: Sie entstanden über lange Zeiträume hinweg und ihre Vorläufer existieren teilweise auch schon bei Primaten [18, 21].

Analyse von Punktmutationen

Bei der molekularen Blutgruppenbestimmung müssen jeweils mehrere verschiedene SNVs, die häufig auf unterschiedlichen Genen liegen gleichzeitig an einzelnen oder zahlreichen Proben bestimmt werden.
Seit Mitte der 1990er-Jahre setzt man hierfür die PCR using sequence specific priming (PCR-SSP, auch genannt Amplification-Refractory Mutation System – ARMS) ein. Hierbei wird jede Mutation und ggf. auch ihr Wildtyp-Allel mit zwei separaten PCRs, aber mit identischen PCR-Programmen bestimmt. Auch weitere Mutationen, die von Interesse sind, können parallel geschaltet werden. Die Probenergebnisse liegen schnell (nach weniger als drei Stunden) vor. Haplotypen, also Nukleotidsequenzen, die auf einem Chromosom liegen, können direkt bestimmt werden. Das Double-ARMS-Verfahren ist in der Lage, beide Varianten von zwei benachbarten SNVs mit vier getrennten PCRs spezifisch nachzuweisen (z. B. bei der genetischen Diskrimination von RhE und Rhe). Die PCR-SSP-Systeme sind leicht um neue SNVs erweiterbar. Mit verschiedenen zusammengefassten Modulen bzw. Kits kann jede Blutgruppe für sich analysiert werden (z. B. RHD getrennt von KEL). Die Ergebnisse wertet man mithilfe von Agarosegelen aus. Nachteil der PCR-SSP sind die tiefen bis mittleren Durchsatzzahlen: Die „Schmerzgrenze“ für das Laborpersonal liegt hier bei wenigen Dutzend Untersuchungen pro Tag.
Andere kommerziell erhältliche Blutgruppenbestimmungen sind auf einen größeren Probendurchsatz, z. B. für die Spendertypisierung, ausgerichtet. Die Detektion beruht bei Real-time-, Chip- oder Bead-basierter PCR auf Fluoreszenzverfahren. Zudem nutzen die Labore eine große Anzahl von In-house-Verfahren. Mit MALDI-TOF MS (Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Ionisation gekoppelt mit Massenspektrometrie) können Detektionskapazitäten von bis zu 36 SNVs gleichzeitig an mehreren Tausend Proben pro Tag erreicht werden [18].

Next Generation Sequencing

Hochdurchsatzverfahren für die DNA-Sequenzierung, wie das Next Generation Sequencing (NGS), eröffnen auch in der molekularen Blutgruppendiagnostik neue Perspektiven. Hier werden Verfahren für die Routine etabliert, um simultan zahlreiche Genotypen von Blutgruppen zuverlässig an einer große Anzahl von Blutspendern zu bestimmen [22]. Auch bei der molekulargenetischen Aufklärung von Mutationen, wie z. B. der Deletion von ca. 100 Kilobasenpaaren im GYPB-Gen, wie sie bei Schwarzafrikanern bei der Blutgruppe MNS vorkommt und zum Phänotyp S-s-U- führt, leistet das NGS hervorragende Dienste [23, 24].
In der Pränataldiagnostik kann man die RhD-Phänotypisierung des Fötus an fetaler DNA nicht-invasiv aus dem Plasma der Mutter vornehmen. Hier ist es mit herkömmlichen Verfahren jedoch schwierig zwischen „richtigen“ negativen und falsch-negativen Ergebnissen, die durch zu geringe Mengen an zellfreier fetaler DNA entstehen, zu unterscheiden. Durch zielgerichtete parallele Sequenzierung von kurzen DNA-Fragmenten könnten fetale Allele für viele SNVs parallel bestimmt werden und so einen Beweis für ein tatsächlich negatives Ergebnis liefern [24, 25].

¹Die vier Antigene KEL1, KEL2, KEL3 und KEL4 von insgesamt 36 Antigenen des Blutgruppensystems Kell: K = Kell, k = Cellano, Kp^a = Penney, Kp^b = Rautenberg

Literatur

1. ISBT: Committee on Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/
2. Sarfarazi M et al. Hum Genet 1983; 65: 169-171.
3. Colin Y et al. J Biol Chem 1986; 261: 229-233.
4. Huang CH et al. Blood 1987; 70: 1830-1835.
5. Daniels G und Reid ME. Transfusion 2010; 50:281-289.
6. Tilley L et al. Vox Sang; 98: 151-159.
7. Helias V et al. Nat Genet 2012; 44: 170-173.
8. Saison C et al. Nat Genet 2012; 44: 174-177.
9. Zelinski T et al. Nat Genet 2012; 44: 131-132.
10. Adolfo I et al. Am J Hematol 2013; 88: 66-72.
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12. Cvejic A et al. Nat Genet 2013; 45: 542-545.
13. Ballif BA et al. EMBO Mol Med 2013; 5: 751-761.
14. Yamamoto M et al. Sci Rep 2012; 2: 975.
15. Svensson L et al. Blood 2013; 121: 1459-1468.
16. Anliker M et al. Transfusion 2014; 54: 1817-1822.
17. Daniels G et al. Blood 2015; 125: 3651-3654.
18. Gassner C. Transfusionsmedizin 2017; 7: 87-94.
19. Omae J et al. Transfusion 2019; 59(7): 2429-2435.
20. Stenfelt et al. Biochem Biophys Rep 2019; 19: 100659.
21. Matassi G et al. J Mol Evol 1999; 48: 151-159.
22. Fürst D et al. Transfus Med Hemother 2020; 47: 1.
23. Gassner C et al. Transfus Med Hemother 2020; DOI: 10.1159/000504946.
24. Gassner C. Transfus Med Hemother 2020; 47: 2-3.
25. Wienzek-Lischka S. Transfus Med Hemother 2020; DOI: 10.1159/000505161.

Autor

Prof. Mag. Dr. rer. nat. Christoph Gassner

Private Universität im Fürstentum Liechtenstein

christoph.gassner[at]ufl[dot]li