SARS-CoV-2: Testen, Testen und nochmal Testen

Seit unserer letzten Übersicht der Systeme zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus ist noch nicht einmal ein Jahr vergangen, aber es hat sich seitdem vieles verändert, sowohl die nationale Teststrategie als leider auch das Virus betreffend.
Wir befinden uns seit Dezember 2020 wieder in einer Lockdown-Situation, aber seit es zuverlässige sowie vielfältige Teststrategien und gleich mehrere in Deutschland zugelassene Impfstoffe gibt, besteht Aussicht auf eine Normalisierung der Situation. Im Gegenzug antwortet das Virus allerdings mit ständigen „Strategiewechseln“ in Form von Mutationen, die beispielsweise die Infektiosität erhöhen oder die Immunabwehr unterlaufen können. Das zeigt sich auch an den wieder leicht steigenden Fallzahlen (Stand 4. März 2021). Nach wie vor stellt der direkte Virusnachweis als RNA- oder Antigen das unersetzliche Werkzeug in der Corona-Pandemie dar. Da sich die Aufmerksamkeit jetzt aber auch etwas auf das Immunsystem richtet, beginnen wir die aktuelle Produktübersicht mit der Rubrik „Immunantwort“.

SARS-CoV-2-Nachweissysteme

Übersicht Nachweissysteme

PCR-Test SARS-CoV-2 (RNA-Nachweis)

SARS-CoV-2-Nachweis mittels Next Generation Sequencing

Kontrollmaterialien SARS-CoV-2

Antigen-Tests SARS-CoV-2

Antikörper-Tests SARS-CoV-2

Tests auf neutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV-2

Tests auf SARS-CoV-2-reaktive T-Zellen

Therapiemonitoring und Medikamentenentwicklung COVID-19

Die zelluläre Immunantwort

Die Immunantwort des Menschen ist ein komplexes Geschehen, bestehend aus angeborenen und adaptiven Mechanismen. Bei Letzteren kann man zwischen den zellulär durch T-Lymphozyten vermittelten und den humoralen, aus den B-Lymphozyten vermittelten Immunglobulinen unterscheiden. Nach den angeborenen Mechanismen ist die zelluläre Immunantwort die schnellste. Der labordiagnostische Nachweis beruht auf der Stimulation der Immunzellen in vitro und der anschließenden Detektion bestimmter Interleukine. Drei Firmen stellen in dieser Produktübersicht Systeme zum Nachweis der zellulären Immunantwort vor, von denen eines eine CE-IVD-Zertifizierung besitzt. Die anderen Systeme stehen für den RUO-Gebrauch (research use only) zur Verfügung und müssen daher vom Labor selbst evaluiert werden.

Die Bestimmung der T-Zell-Aktivität läuft auf einer Multitestplatte ab, auf der monoklonale Antikörper gegen die zu detektierenden Zytokine Interleukin-2 und Interferon-γ immobilisiert sind. Durch die Auswahl dieser beiden Interleukine lässt sich gleichzeitig zwischen einer aktiven und einer abgelaufenen Immunreaktion unterscheiden. Denn direkt aktivierte T-Zellen sezernieren in erster Linie Interferon-γ, wogegen Gedächtniszellen hauptsächlich Interleukin-2 ausschütten. Auf der Multitestplatte erfolgt in wässriger Lösung auch die Stimulation der T-Zellen aus den Lymphozyten eines Patienten, die zuvor aus einer Blutprobe gewonnen wurden. Das bedeutet, dass die zellulären Bestandteile und alle ungebundenen Substanzen aus dem Reaktionsansatz entfernt werden, sodass der Festphasen-gebundene Antikörper-Antigen-Komplex zurückbleibt. Für die Stimulation wird spezifisches SARS-CoV-2-Antigen eingesetzt, in der Regel eine Peptid-Mischung. Der eigentliche Nachweis der T-Zell-Reaktion erfolgt immunologisch, entweder mit einen Enzyme-linked Immuno-Spot Assay, oder mithilfe der klassischen ELISA-Technologie. Anschließend werden ein sekundärer Antikörper und dann noch ein dritter Antikörper zugegeben. Dieser Komplex wird dann letztendlich mithilfe einer Farbreaktion in Form eines Spots nachgewiesen. Ein Spot entspricht einer Zytokin-produzierenden Zelle. Das Detektionslimit entspricht laut Hersteller einer aus 200.000 eingesetzten Zellen. Dieser Nachweis kann interessant sein, wenn beispielsweise ein Antikörpernachweis nicht (mehr) positiv ausfällt, obwohl die SARS-COV-2-Infektion durch den direkten Erregernachweis nachgewiesen wurde.

Frische Infektion – oder längst abgeschlossen?

In erster Linie wird jedoch die humorale Immunreaktion in Form der Immunglobuline A, G und M detektiert, um eine Auseinandersetzung mit dem SARS-CoV-2-Virus nachzuweisen. Die Immunglobuline unterscheiden sich durch ihre Struktur und durch den Zeitpunkt der Bildung im Organismus. IgM und IgA werden ungefähr eine Woche bis 14 Tage nach der Infektion gebildet. Der Nachweis dieser beiden Immunglobulin-Typen deutet auf eine frische Infektion hin. Die Besonderheit von IgA ist, dass dieses in den Schleimhäuten, z. B. des Hals-Nasen-Rachenraums, produziert wird. Das IgG wird im weiteren Verlauf der Infektion von den sogenannten Gedächtniszellen gebildet und ist auch nach Monaten bis Jahren noch nachweisbar. IgG gilt deshalb als Marker für eine abgelaufene Infektion.
Antikörperassays sind für viele verschiedene Einsatzgebiete vom Laborautomaten für den Hochdurchsatz bis zum Schnelltest für die Heimanwendung verfügbar.
Für alle Optionen gibt es in der vorliegenden Produktübersicht mehrere Beispiele. So steht für den Einsatz am Point of Care eine Vielzahl an verschiedenen Nachweisverfahren zur Verfügung, angefangen bei chromatografischen Kassettenschnelltests über Chemilumineszenz-, Bio­lumineszenz- und Fluoreszenz-basierte bis hin zu Lateral-Flow-Immunoassays. Außerdem kann die Nachweisreaktion an Nanopartikel oder Mikrosphären gebunden ablaufen.
Einige, wenn auch nicht alle der hier vorgestellten Schnelltests unterscheiden zwischen IgG- und IgM. Alle derzeit angebotenen Antikörper-Nachweissysteme verwenden Epitope der S1-Domäne des Spike-Proteins und/oder ein Protein des Nukleokapsids (s. Abb. 1) als Antigen. Die Schnelltests sind in der Regel qualitativ, bestenfalls semi-quantitativ. Die in dieser Produktübersicht vertretenen Labortests sind sowohl als qualitative als auch als quantitative Nachweise verfügbar.
Einige der hier vorgestellten Assays verwenden die S1- und die S2-Domäne des Spike-Proteins gemeinsam als Epitope zum Nachweis der IgG-Antikörper, weitere Assays sogar das gesamte trimere Spike-Protein. Diese Assays sind dazu geeignet, eine Einschätzung zur neutralisierenden Wirkung der Immunantwort des Wirts zu geben, das heißt, sie lassen eine Aussage zum Impferfolg zu.

Nachweis neutralisierender Antikörper

Ein Assay  ist genau auf die Beantwortung dieser Frage ausgerichtet. Dazu sind Moleküle des ACE-2-Rezeptors, über den das Virus in die Wirtszellen eindringt, auf einer ELISA-Platte immobilisiert. An Moleküle des Rezeptor-bindenden Proteins (RBP) ist dagegen Meerrettich-Peroxidase in wässriger Lösung gebunden. Sind im Blut eines Patienten neutralisierende Antikörper vorhanden, binden diese die Komplexe aus RBP und Meerretich-Peroxidase. Der Antigen-Antikörper-Komplex wird in einem Waschvorgang entfernt. Es kann nicht zur Bindung des Rezeptor-bindenden Proteins an den ACE-2-Rezeptor kommen. Es sind neutralisierende Antikörper vorhanden.

Nachweis der Virionen

Der Antigen-Nachweis, der vor einem Jahr noch wenig Beachtung fand, weil belastbare Daten noch fehlten, ist neben der Impfung aktuell der Hoffnungsschimmer in Richtung eines halbwegs normalen Lebens. Der Antigen-Test – insbesondere der Schnelltest – soll dazu beitragen, hochinfektiöse Personen auch ohne PCR zu erkennen und so die Virusverbreitung zu vermindern.
Dabei lässt sich ein Teil der Assays mittlerweile bereits aus einem einfacher durchzuführenden und für den Probanden angenehmeren Nasenabstrich oder aus Speichel durchführen. Die Probenentnahme muss dann nicht mehr von medizinischem Personal durchgeführt werden. Als Virus-Epitop für den Antigen-Test werden in der Regel das Nukleokapsid- oder die S1-Region des Spike-Proteins verwendet (s. Abb. 1).

Der Antigen-Test ist um einen Faktor von etwa 1.000 weniger sensitiv als die Nukleinsäureamplifikation, kann aber in Situationen eingesetzt werden, in denen die Kontagiosität von Personen schnell eingeschätzt werden muss [1]. Er deckt Infektionen mit bereits hoher Viruslast auch dann auf, wenn keine oder nur geringe Symptome vorliegen. Für den Antigen-Schnelltest finden meist chromatografische, Lateral-Flow- oder Fluoreszenz-Immunoassays Verwendung. Im Labor stehen Enzyme-linked Immunosorbent(ELISA)- und Chemilumineszenz-Assays (CLIA) zur Verfügung, die auf den Hochdurchsatzsystemen der Klinischen Chemie oder der Serologie laufen können. Auch die Schnelltests können automatisiert werden. Das hat den Vorteil, dass das Ablesen standardisiert erfolgt. Außerdem können die POC-Geräte direkt an das Laborinformationssystem oder eine Middleware angeschlossen werden, sodass die Ergebnisse direkt im LIS erfasst sind und entsprechend ausgewertet bzw. über die DEMIS-Schnittstelle an die Gesundheitsämter bzw. an das Robert Koch-Institut oder an die Corona-Warn-App weitergeleitet werden – eine große Erleichterung für das medizinische Personal. Auch die Antigen-Schnelltests liefern qualitative Ergebnisse, die Labor­tests können qualitativ oder quantitativ ausgewertet werden.

Direktnachweis der Virus-RNA

Der Goldstandard des SARS-CoV-2-Nachweises ist laut Paul-Ehrlich-Institut nach wie vor die Nukleinsäureamplifikation. Dabei wird explizit die Polymerase-Ketten­reaktion genannt. Der überwiegende Teil der Hersteller bietet PCR-Methoden an und verwendet dabei das Real-time-Verfahren, bei dem die Entstehung der Amplifikationsprodukte kontinuierlich verfolgt werden kann. Der Erfolg des Nachweises steht und fällt mit den verwendeten Primern, mit den Oligonukleotiden, die anhand der bekannten Sequenzen der Virus-RNA für den Nachweis ausgewählt wurden. Die meisten Hersteller detektieren mit ihren Assays mindestens zwei verschiedene RNA-Regionen des Virus, einige sogar drei.
In Tab. 1 sind die am häufigsten für die Amplifikation verwendeten RNA-Domänen des SARS-CoV-2-Virus und die korrespondierenden Proteine aufgeführt.

Die Hersteller geben genau an, gegen welche Regionen sich ihre Nachweissysteme richten. In der Schemazeichnung des Virions (Abb. 1) sind die dazugehörigen Strukturen dargestellt.

RNA-Nachweis am Point of Care

Der direkte RNA-Nachweis kann auch am Point of Care in einem Zeitrahmen zwischen 20 bis 70 Minuten durchgeführt werden. Dafür werden sowohl PCR- als auch isothermale Verfahren eingesetzt. Multiplex ist schon bei nahezu allen Herstellern Standard. Außerdem können auch diese POC-Geräte mit der Labor-EDV vernetzt werden, sodass die Ergebnisse sofort an den richtigen Stellen zur Verfügung stehen.
Alle Verfahren haben eines gemeinsam: die schnelle, einfache Handhabung von in der Regel höchstens einer Minute. Die größten Unterschiede liegen in der Nukleinsäureamplifikation und dem Nachweis der Amplifikate. Die PCR kann als Endpunktbestimmung oder als Real-time-Verfahren eingesetzt werden. Die genauen Zeiten entnehmen Sie bitte den Herstellerangaben.

Isothermale Nukleinsäureamplifikation

In unserer Produktübersicht sind auch einige Anbieter einer isothermalen Amplifikationsmethode vertreten, der sogenannten Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP, s. Abb. 2).

Auch hier wird nach der Nukleinsäureextraktion und -isolierung von der Erreger-RNA mithilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase ein komplementärer DNA-Strang erzeugt. Für die isothermale Amplifikation wird eine Polymerase benötigt, die bei höheren Temperaturen aktiv ist, denn die isothermale Amplifikation läuft bei einer konstanten Temperatur von 65 °C ab. Außerdem ist es erforderlich, dass die Polymerase den Gegenstrang während der Amplifikation verdrängt. Die dritte Besonderheit betrifft die eingesetzten Primer. Zum Einsatz kommen vier bis sechs Primer mit sechs bis acht Bindungsstellen auf der Ziel-DNA. Zwei der Primer hybridisieren mit sich selbst; sie bilden so genannte Loops, die sofort wieder neue Ansatzstellen für die Bildung von DNA-Strängen darstellen. Dadurch entstehen sehr schnell sehr viele Amplifikationsprodukte, deren Bildung wie bei der PCR verfolgt werden kann. Die rein qualitative Methode braucht weniger aufwändiges Equipment als die PCR und eignet sich deshalb besonders gut für den Einsatz am POC. Ein weiterer Zeitgewinn entsteht, wenn keine RNA-Extraktion erforderlich ist, wie das bei einem der Anbieter der Fall ist.

Testkits für bewährte Systeme

Seit Kary Mullis und Michael Smith 1983 die PCR entwickelt haben, hat sich die Methode unglaublich vielfältig entwickelt. Aber Nukleinsäureextraktion und -aufreinigung bilden nach wie vor die Basis. Dafür gibt es seit vielen Jahrzehnten bewährte Systeme, sowohl für die Probenvorbereitung als auch für die eigentliche Vervielfältigung der Nukleinsäuren, auf denen Testkits zahlreicher Hersteller laufen können. Die Testkits enthalten alle erforderlichen Primer, Sonden, Enzyme, Nukleotide, Reagenzien und Kontrollen. Unabhängige Kontrollen sind wertvolles Material, das in der aktuellen Produktübersicht nur von einem Anbieter vorgestellt wird. Einige Hersteller sind dazu übergegangen, die Kits in lyophilisierter Form auszuliefern, was die Haltbarkeit und das Handling deutlich vereinfacht und auch einen deutlichen Schritt in Richtung Automatisierung darstellt.

Nukleinsäureamplifikation im Hochdurchsatz

Mehrere Firmen stellen in dieser Tabelle ihre Vollautomaten für den Virusnachweis im Hochdurchsatz vor. Dabei wird mit einer Ausnahme die klassische PCR als Methode zum Nachweis von mindestens zwei voneinander unabhängigen Zielsequenzen eingesetzt. Eine Variante der PCR verwendet die sogenannte 3Basen-Technologie, bei der vor Extraktion und Amplifikation in einer chemischen Desaminierung Cytosin in Uracil umgewandelt wird. Der ursprünglich aus vier verschiedenen Basen aufgebaute RNA-Strang setzt sich nur noch aus drei unterschiedlichen Basen zusammen. Anschließend erfolgt eine Standard-Probenvorbereitung und Real-time-PCR. Laut Hersteller erhöht die 3Basen-Technologie die Homologie zwischen den Sequenzen und vermindert falsch-positive Signale  durch Kreuzkontaminationen. Der Hersteller liefert nicht nur Geräte für den mittleren bis hohen Durchsatz, sondern garantiert die Lieferung aller erforderlichen Komponenten.
Syndromisches Testen ist besonders in der Wintersaison eine gute Methode, um zwischen den respiratorischen Erkrankungen mit ähnlichen Symp­tomen zu differenzieren. Es stehen die verschiedensten Nachweiskombinatio­nen zur Verfügung, beispielsweise für SARS-CoV-2 und Influenza A/B oder das respiratorische Synzytial-Virus (RSV). Die Auswahlmöglichkeiten umfassen sogar die Erkennung von 23 unterschiedlichen Erregern, darunter auch Bakterien. Der Nachweis ist auch am POC möglich. Einen guten Überblick über die Assays zu diesem Thema bietet die „Tabelle respiratorischer Erreger“ auf unserer Webseite.

Varianten, die uns treffen

Wie bereits eingangs erwähnt haben nicht nur wir uns weiterentwickelt, sondern auch das Virus. Mittlerweile sind einige variants of concern (VOC), wie sie vom Robert Koch-Institut genannt werden, aufgetaucht, die nach dem Land ihrer Erstentdeckung benannt sind (s. Tab. 2).

Der Anteil der neuen Varianten, insbesondere B.1.1.7, liegt aktuell bei ca. 54 % aller in Deutschland durchgeführten Sequenzierungen (Stand 9. März).Sie sind aus unterschiedlichen Viruslinien entstanden und besitzen die verschiedensten Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs), Deletionen und Mutationen. Eine davon haben aber alle gemeinsam: Eine Mutation, die sich durch eine bessere Bindung an den ACE-2-Rezeptor auszeichnet, über den das Virus in die menschlichen Zellen gelangt. Dadurch hat sich die Infektiosität dieser Varianten erhöht. Das RKI berichtet bereits von einer abnehmenden Wirksamkeit der neutralisierenden Antikörper, was wiederum zu einer Abnahme des Impferfolgs führen kann [2]. Assays zum Nachweis der Wirksamkeit neutralisierender Antikörper haben wir bereits vorgestellt.
In Verbindung mit den neuen Virusvarianten entstand der Ruf nach regelmäßigem whole genome sequencing in kürzeren Zeitabständen. Zwei Firmen sind in dieser Übersicht vertreten, die Produkte für das next generation sequencing anbieten.
Mittlerweile haben auch die Anbieter der Nukleinsäureamplifikations-Verfahren reagiert und bieten eine Variantentestung an. Weitere namhafte Hersteller ziehen nach. Die PCR-Reaktio­nen weisen bereits die fünf auffälligsten Mutationen im Spike-Protein nach und ordnen diese den neuen Varianten zu. Allerdings haben diese Assays zum Zeitpunkt der Drucklegung noch den Status research use only (RUO). Die CE-IVD-Zertifizierung ist zum Teil für Ende März angekündigt. Der Hersteller hat das Multiplex-Verfahren so weiterentwickelt, dass echtes Multiplexing in einem Kanal stattfinden kann.

Ich danke Herrn Jonas Heisterkamp für die Zusammenstellung der Tabelle und die fachliche Unterstützung bei der  Recherche.

Dr. Gabriele Egert
Mitglied der Redaktion