CAR-T-Zellen: Wie Designer-Immun­zellen gegen den Krebs scharfgemacht werden können

Der modulare Aufbau eines CAR erlaubt die gezielte Beeinflussung der T-Zell-Funktion

Viele Parameter wurden in den letzten Jahren identifiziert, die die Effektivität eines CAR in der T-Zellaktivierung bestimmen; sowohl die extrazellulären als auch die intrazellulären Module eines CARs können vielfältig modifiziert und neu kombiniert werden (Abb. 1). Ein CAR der „ersten Generation“ besitzt eine Si­gnalkette für die primäre T-Zell-Aktivierung, meist die CD3ζ-Signalkette; ein CAR der „zweiten Generation“ verwendet die CD3ζ-Kette zusammen mit einer kostimulatorischen Einheit, bevorzugt aus der CD28-Familie, um eine anhaltende T-Zell-Aktivierung zu erzielen [2]. Wir waren eine der ersten Gruppen, die den kombinierten CD28-ζ-CAR entwickelten und die spezifische Steuerung der Effektorfunktionen beschrieben [3]. Andere kostimulatorische Signaleinheiten wie OX40 (CD134) und 4-1BB (CD137) werden inzwischen gleichermaßen verwendet, wobei die jeweilige Kostimulation unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell-Funktion nimmt. Ein CAR mit CD28-Kostimulation induziert bevorzugt „effector memory“ T-Zellen mit erhöhter Glykolyse, während ein 4-1BB-CAR „central memory“ T-Zellen mit erhöhter Fettsäure-Oxidation stimuliert [4]. Wiederholte Stimulation der T-Zelle durch den CAR führt schließlich zur terminalen Differenzierung und Zellalterung; ein CAR der „dritten Generation“ mit kombinierter CD28-OX40-Kostimulation kann dem entgegen wirken.
Kürzlich entwickelten wir CAR-T-Zellen der „vierten Generation“, die sogenannten TRUCKs, die sich dadurch auszeichnen, dass sie nach Aktivierung durch den CAR in dem Tumorgewebe als „lebende Fabriken“ transgene Produkte freisetzen, die natürlicherweise nicht von den T-Zellen produziert werden [5]. Wir entwickelten einen TRUCK, um das Zytokin IL-12 im Tumorgewebe abzulagern und dadurch eine sekundäre Immunreaktion durch Rekrutieren der Zellen des angeborenen Immunsystems, wie NK-Zellen oder Makrophagen, zu initiieren und die Anti-Tumor-Antwort zu verbessern.
Durch die Verwendung eines Antikörpers als Bindedomäne können die CAR-T-Zellen gegen Antigene auf der Oberfläche der Zielzelle gerichtet werden, die durch den TCR einer T-Zelle nicht erkannt werden können. So zeigten wir, dass es mithilfe eines CARs ermöglicht wird, T-Zellen spezifisch gegen Karbohydrat­antigene zu richten, die von einer Vielzahl von Tumoren exprimiert werden, wie beispielsweise CEA, CA19-9 oder TAG72. Auch ist eine Antigen-Erkennung unabhängig von der HLA-Präsentation vorteilhaft, da Tumorzellen häufig einen Defekt in der Antigenprozessierung und/oder -präsentation haben und dadurch das Antigen nicht dem TCR der T-Zelle präsentiert wird.
Jedoch ist nicht jeder Antikörper und jedes Antigen als Binde- und Zielstruktur eines CAR gleichermaßen geeignet. Das vom CAR erkannte Epitop des Anti­gens, dessen Zugänglichkeit für den CAR auf der Oberfläche der Tumorzelle, die Distanz des Epitops zur Zellmembran, die Länge der extrazellulären CAR-Domäne, sowie die Bindeaffinität des CAR zum Antigen haben einen erheblichen Einfluss auf die CAR-vermittelte T-Zell-Aktivierung. Im Gegensatz zum therapeutischen Antikörper scheint eine mittlere bis geringe Bindeaffinität des CAR von Vorteil zu sein; eine Steigerung der Bindeaffinität über eine Schwelle hat keine weitere Steigerung der T-Zell-Funktionen zur Folge [6].

Die Herstellung der CAR-T-Zellen erfordert einen komplexen biotechnologischen Prozess

Die T-Zellen werden aus dem Blut der Patienten durch Leukapherese isoliert, im Labor zur Zellteilung stimuliert, mithilfe eines retro- oder lentiviralen Vektors mit dem CAR ausgestattet und zu klinisch relevanten Zellzahlen für die anschließende Transfusion in den Patienten vermehrt. Der Vektor kodiert für den CAR und vermittelt eine permanente genetische Modifikation der T-Zelle, sodass die Information für den CAR auch nach Am­plifikation der T-Zellen erhalten bleibt. Bei der Verwendung reifer T-Zellen aus dem Blut ist eine mögliche Insertionsmutagenese durch den viralen Vektor im Gegensatz zu hämatopoetischen Stammzellen klinisch nicht relevant. Lentivirale Vektoren haben generell ein geringeres mutagenes Insertionsprofil und zeigen eine geringere Suppression der Expressionskassette im Vergleich zu retroviralen Vektoren, jedoch ist die Produktion hinreichend hoher Titer technologisch sehr anspruchsvoll. Aus dieser Sicht werden zunehmend nicht-virale Systeme zur Generierung der CAR-T-Zellen entwickelt, wie beispielsweise Transposon-vermittelte DNA-Modifikationen.
Die genetische Modifikation durch Vektor-Transduktion und die Amplifikation der T-Zellen im Labor erfolgt in einem komplexen Prozess unter GMP („Good Manufacturing Practice“)-Bedingungen, der bis zu 14 Tage in Anspruch nimmt und eine besondere Herausforderung an die Effizienz, Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle darstellt. Insbesondere erfordert der Prozess aufwendige und langwierige manuelle Arbeiten zur Herstellung des Zellprodukts von jedem einzelnen Patienten. Es werden deswegen erhebliche Anstrengungen unternommen, den manuellen Prozess in Richtung einer industriellen Herstellung durch einen automatisierten und überwachten Ablauf in einem geschlossenen System zu ersetzen. Dies würde die parallele Herstellung der CAR-T-Zellen für eine größere Patientenzahl und für eine breitere Anwendung erleichtern.

CAR-T-Zellen sind in der Behandlung von B-Zell-Leukämien sehr erfolgreich

Kürzlich sind die ersten Phase-I-Studien mit CAR-T-Zellen in der Behandlung von B-Zell-Leukämien und Lymphomen abgeschlossen worden. Der adoptive Transfer CD19-spezifischer CAR-T-Zellen induzierte langfristige Remissionen bei Patienten mit CD19-positiver akuter Lymphoblasten-Leukämie (ALL) und chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) sowie bei CD19-positiven B-Zell-Lymphomen. Dabei wurden in 90% der Fälle durch anschließende allogene Stammzelltransplantation komplette Remissionen bei der kindlichen ALL erreicht [7]. Dieses ist umso bemerkenswerter, da die Patienten in weit fortgeschrittenen Stadien ihrer Erkrankung behandelt wurden, bei denen sich bisherige Therapien als wirkungslos erwiesen haben. Neben der erfolgreichen Therapie hämatologischer Erkrankungen ist der Bericht einer andauernden Remission in der Behandlung eines Glioblastoms nach Transfer der CAR-T-Zellen mit Spezifität für Interleukin-13-Rezeptor alpha-2 (IL13Rα2) [8] sowie der Therapie CEA-positiver gastrointestinaler Tumoren vielversprechend [9]. Viele weitere Zielstrukturen werden derzeit auf ihre Eignung für die CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen Tumoren entwickelt und in Studien erprobt [10].
Nach Transfusion expandieren die CAR-T-Zellen im Patienten und können im peripheren Blut und im Knochenmark für 6 Monate und länger persistieren; dabei kann die Anzahl der CAR-T-Zellen bis zu 1000-fach gegenüber der Zahl applizierter CAR-T-Zellen ansteigen. Deswegen können auch niedrige Dosen in der Größenordnung von 10e5 CAR-T-Zellen pro kg Körpergewicht therapeutisch effektiv sein. Die CAR-T-Zell-Amplifikation und Persistenz ist ein guter prädiktiver Marker für die therapeutische Wirksamkeit. Man versucht deswegen, durch eine nicht-mye­loablative Lymphodepletion vor CAR-T-Zell-Applikation („Präkonditionierung“) genügend Raum und Zytokine für die applizierten CAR-T-Zellen zur Verfügung zu stellen.
Bei der Therapie mit Anti-CD19-CAR-T-Zellen kommt hinzu, dass die T-Zellen eine wiederholte Stimulierung durch den CAR nach Bindung an gesunde CD19+ B-Zellen erfahren, die dann durch die stimulierten CAR-T-Zellen eliminiert werden. Eine Nebenwirkung der Anti-CD19-CAR-T-Zelltherapie ist folglich die anhaltende Aplasie der gesunden B-Zellen, was jedoch klinisch gut beherrschbar ist. Diese sog. „on-target off-tumor“ Aktivierung der CAR-T-Zellen ist jedoch ein erhebliches Risiko, wenn die CAR-T-Zellen ihr Zielantigen nicht nur auf Tumorzellen, sondern auch auf anderen gesunden Geweben finden, die nicht angegriffen werden dürfen. So erzeugten CAR-T-Zellen mit Spezifität für ErbB2 (Her2/neu) eine Toxizität gegen gesundes Lungengewebe mit physiologischer ErbB2-Expression. Derartige Autoimmunreaktionen durch die CAR-T-Zellen können Therapie-limitierend werden und führten in einigen Studien zum Abbruch der Therapie. Derzeitige Forschungen konzentrieren sich darauf, die Selektivität des CAR in der Erkennung der Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Zellen zu erhöhen, beispielsweise durch Identifizierung selektiverer Zielantigene.
Auch die erfolgreiche Eliminierung einer großen Anzahl Tumorzellen geht häufig mit erheblichen Nebenwirkungen einher, insbesondere mit einem Tumor-Lysis-Syndrom, „vascular leakage syndrome“ oder einem „Zytokin-Sturm“ mit einem Anstieg pro-inflammatorischer Zytokine, insbesondere IL-6 und IFN-γ. Die klinische Symptomatik des Zytokin-Sturms kann durch Antikörper-vermittelte Neutralisierung des IL-6-Rezeptors vermindert werden, ohne dass die klinische Effektivität der CAR-T-Zellen beeinträchtigt wird. Mit der zunehmenden Anzahl Patienten und Studien beginnt man zu lernen, diese und andere Nebenwirkungen frühzeitig zu erkennen und entsprechend zu behandeln, sodass die Durchführung einer CAR-T-Zelltherapie sicherer wird.

Wie wird die CAR-T-Zelltherapie der Zukunft aussehen?

Nach den spektakulären Erfolgen in der Behandlung von Leukämien und Lymphomen mit CAR-T-Zellen konzen­triert sich die Forschung jetzt darauf, diese Strategie auch für andere maligne Erkrankungen, insbesondere solide Tumoren, anzuwenden. Zunächst müssen jedoch einige technische und biologische Probleme überwunden werden.
Die CAR-T-Zellen müssen effizient die Tumorläsionen erreichen. In ersten Studien wurden die CAR-T-Zellen durch lokale Applikation, beispielsweise durch Punktion zuführender Gefäße, in den Tumor gebracht, so bei der Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren (NCT01722149) und gastrointestinalen Tumoren (NCT00673322). Diese Strategie ist jedoch nicht für alle Tumoren und deren Meta­stasen anwendbar; langfristig müssen die CAR-T-Zellen nach systemischer Applikation ihren Weg durch den Blut- und Lymphstrom zum Tumor finden können, um auch kleine und versteckte Tumor­metastasen zu erreichen.
Die Lymphodepletion des Patienten vor der adoptiven T-Zelltherapie erfolgt mit dem Ziel, die Amplifikation der CAR-T-Zellen im Patienten zu unterstützen, was jedoch mit erheblichen Belastungen für den Patienten behaftet ist; alternative Strategien zur Steuerung der T-Zell-Amplifikation nach Applikation im Patienten sind gefordert. Eine T-Zell-Stimulation mit niedrig dosiertem IL-2 wird häufig in dieser Situation durchgeführt; alternativ werden Virus-spezifische T-Zellen verwendet, die durch Kontakt mit Virus-infizierten Zellen eine Restimulation unabhängig vom CAR erhalten.
Neben T-Zellen wird die CAR-Technologie auch für andere Immunzellen erprobt, beispielsweise werden CAR-modifizierte natürliche Killer (NK)-Zellen derzeitig in ersten klinischen Studien angewendet (z. B. NCT00995137, NCT01974479). NK-Zellen können im Gegensatz zu T-Zellen auch als allogene Zellen von gesunden Spendern eingesetzt werden. Entwicklungen in der Verwendung von etablierten NK-Linien für die CAR-Therapie sind inzwischen weit fortgeschritten und in der klinischen Erprobung.
Eine neuere Strategie nutzt CAR-T-Zellen als „lebende Fabriken“, die nach CAR-Bindung an das Zielantigen ein transgenes Zytokin oder andere therapeutisch wirksame Proteine freisetzen. Durch die Verwendung derartiger CAR-T-Zellen der „vierten Generation“, sog. TRUCK-Zellen, könnte ein neues Feld der Applikation von Therapeutika im Zielgewebe eröffnet werden.
Zahlreiche solide Tumoren schirmen sich durch eine wirksame Immunsuppression von einem Immunangriff ab, sodass die CAR-T-Zellen nicht in den Tumor penetrieren und keine T-Zell-Aktivierung aufbauen können. Erhebliche Anstrengungen werden derzeitig unternommen, um die Immunsuppression am Tumor zu überwinden, beispielsweise durch Blockade der PD-1-vermittelten Suppression während der CAR-T-Zelltherapie.
Für die breite Anwendung der CAR-T-Zelltherapie besteht eine weitere technische Limitierung darin, dass für jeden Patienten die eigenen T-Zellen isoliert, modifiziert und amplifiziert werden müssen. Dieses kann sich als besonders ineffizient bei Tumorpatienten in fortgeschrittenen Stadien erweisen, wenn nur noch wenige aktive T-Zellen verfügbar sind. Die Verwendung allogener Lymphozyten gesunder Spender könnte Vorteile haben, wenn es gelingt, die fremden T-Zellen so zu modifizieren, dass sie nicht vom Immunsystem des Patienten erkannt werden, um eine Abstoßungsreaktion zu zu vermeiden. Derartige allogene CAR-T-Zellen könnten vorab generiert und gelagert werden („CAR-T cell banking“) und stünden für eine große Zahl Patienten bei Bedarf zur Verfügung.
Bei allen Anstrengungen bleibt derzeitig die CAR-T-Zelltherapie eine individualisierte Therapie, die einen CAR spezifisch für den jeweiligen Tumor und die Modifikation der T-Zellen für jeden Patienten in einem komplexen biotechnologischen Herstellungsprozess erfordert. Trotz aller Schwierigkeiten wird die konzertierte Forschungsaktivität vieler Gruppen weltweit uns mehr und mehr Instrumente und Strategien an die Hand geben, die erstaunliche Effektivität des Immunsystems in der Kontrolle von Tumoren zum Wohle der Patienten nutzen zu können.

Danksagung

Arbeiten in dem Labor des Autors werden durch folgende Institutionen unterstützt: Deutsche Forschungsgemeinschaft, Deutsche Krebshilfe, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung, Wilhelm-Sander-Stiftung, Europäische Union, Land Nordrhein-Westfalen und die Medizinische Fakultät der Universität zu Köln.

Literatur
1. Eshhar Z et al. (1993). Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, 90:720–724.
2. Finney HM et al. (1998). Chimeric receptors providing both primary and costimulatory signaling in T cells from a single gene product. J Immunol, 161:2791–2797.
3. Hombach A et al. (2001). Tumor-specific T cell activation by recombinant immunoreceptors: CD3 zeta signaling and CD28 costimulation are simultaneously required for efficient IL-2 secretion and can be integrated into one combined CD28/CD3 zeta signaling receptor molecule. J Immunol, 167:6123–6131.
4. Kawalekar OU et al. (2016). Distinct signaling of coreceptors regulates specific metabolism pathways and impacts memory development in CAR T cells. Immunity, 44:380–390.
5. Chmielewski M et al. (2011). IL-12 release by engineered T cells expressing chimeric antigen receptors can effectively Muster an antigen-independent macrophage response on tumor cells that have shut down tumor antigen expression. Cancer Res, 71:5697–5706.
6. Chmielewski M et al. (2004). T cell activation by antibody-like immunoreceptors: increase in affinity of the single-chain fragment domain above threshold does not increase T cell activation against antigen-positive target cells but decreases selectivity. J Immunol, 173:7647–7653.
7. Pan J et al. (2017). High efficacy and safety of low dose CD19-directed CAR-T cell therapy in 51 refractory or relapsed B acute lymphoblastic leukemia patients. Leukemia, doi: 10.1038/leu.2017.145
8. Brown CE et al. (2016). Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. N Engl J Med, 375:2561–2569.
9. Zhang C et al. (2017). Phase I escalating-dose trial of CAR-T therapy targeting CEA+ metastatic colorectal cancers. Mol Ther, 25:1248–1258.
10. Holzinger A et al. (2016). The growing world of CAR T cell trials: a systematic review. Cancer Immunol Immunother, 65:1433–1450.