Extrazelluläre Vesikel: Eine Goldmine für neue Biomarker

In der Labormedizin und Pathologie ist die zelluläre Diagnostik seit vielen Jahren Goldstandard für die Diagnose vieler verschiedener Erkrankungen: Durch das Bestimmen der absoluten und relativen Anzahl der Blutzellen sowie qualitativen Merkmale wie Größe, Morphologie, biochemische und genetische Merkmale können Erkrankungen von Anämie über Infektionen, Sepsis, Leukämie und Lymphom bis hin zu Gerinnungsstörungen erkannt werden. In ähnlicher Weise beruht die histopathologische Gewebediagnostik auf morphologischen und molekularbiologischen Veränderungen der Zellen in ihren Organverbünden.
Im Gegensatz dazu wurden subzelluläre Partikel lange als zellulärer Abfall betrachtet. Ebenso unterschätzte man nicht-kodierende Regionen im Genom stark, bis das ENCODE-Projekt zeigte, dass dieses reichlich vorhandene genetische Material für die Regulation und Feinabstimmung der Transkription, Stummschaltung und Aktivierung genomischer Regionen und Reparaturprozessen von großer Bedeutung ist [1]. Mit dem Aufkommen neuer hochempfindlicher und hochauflösender Technologien hat das Forschungsinteresse an diesen subzellulären Partikeln enorm zugenommen und faszinierende Einblicke in ihre Struktur, Biologie, zelluläre Freisetzung und Funktion geliefert. Mehr und mehr wurde nun ihre Schlüsselrolle für die Kommunikation von Zelle zu Zelle, die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichts im Organismus und die Anpassung an äußere Herausforderungen sowie für die Pathogenese und das Fortschreiten einer Vielzahl von Erkrankungen erkannt [2].

Heterogene Gruppe von EV

Extrazelluläre Vesikel (EV) gelten als Partikel mit einer Lipiddoppelschichtmembran, die auf natürliche Weise aus Zellen freigesetzt werden [3]. Sie umfassen ein breites Spektrum an heterogenen subzellulären Vesikeln, deren Größe, Dichte, Oberflächenzusammensetzung, biochemischer Inhalt, Bildungsmechanismus, Freisetzung aus Zellen und biologische Funktionen stark variieren (Abb. 1) [3, 4].

Die Größe von EV liegt im Allgemeinen zwischen 50 und über 1.000 nm. Kleine EV wie Exosomen (50 bis 150 nm) entstehen durch einen speziellen Bildungsmechanismus im endosomalen System mit intrazellulärer Reifung in multivesikulären Körperchen und anschließender sekundärer Freisetzung aus den Zellen. Im Gegensatz dazu führen direkte Abschnürungen von der Plasmamembran zur Bildung größerer Mikrovesikel (MV) mit einer Größe von 100 bis 1.000 nm. Darüber hinaus werden andere EV wie Ektosomen, apoptotische Körperchen und Onkosomen von bestimmten Zelltypen oder sterbenden Zellen freigesetzt [2–4].
EV werden in unterschiedlichen Mengen aus gesunden, gestressten, verletzten und malignen Zellen sowie aus Thrombozyten, Stammzellen, Zellen des Immunsystems und vielen anderen Zellen abgegeben [3, 5–7]. Sie unterscheiden sich in der Zusammensetzung ihrer Membranen,  in welche Transmembran-Tetraspanine, Proteine, Lipid Rafts, Zucker, Nukleinsäuren, MHC-Komplexe, Integrine und andere zelltypspezifische Marker eingebaut sind [2, 3]. Diese ermöglichen es ihnen, parakrin interzelluläre Kontakte mit benachbarten Zellen herzustellen oder sogar endokrin gezielt mit entfernten Zellen zu interagieren, nachdem sie in die Blutbahn oder andere Körperflüssigkeiten freigesetzt wurden [3, 5, 7].
EV transportieren unterschiedliche „Fracht“ (Abb. 2). 

Aus der Plasmamembran abgelöste Mikrovesikel enthalten entweder Moleküle, die aus Zytosol, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat, dem endoplasmatischen Retikulum stammen, oder sogar Organellen selbst. Die Mechanismen des spezifischen Beladens von Mikrovesikeln werden derzeit untersucht. Es wurde gezeigt, dass bestimmte RNA-bindende Proteine in MV gelangen können und so zu einem spezifischeren Beladen mit miRNAs führen [8]. Endosomale Exosomen haben einen Mechanismus, der das spezifische Beladen mit Proteinen, Lipiden, Enzymen, DNA, verschiedenen Formen von RNA (rRNA, tRNA, mRNA, miRNA und andere nicht-kodierende RNA) reguliert. Dieser Mechanismus kann über ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) bzw. über akzessorische Proteine vermittelt werden oder aber davon unabhängig sein [2, 3, 9].

Funktionen und Anwendung

Nach spezifischer Bindung an die Oberfläche der Zielzelle, Endozytose oder Fusion mit der Plasmamembran kann der Inhalt der EV im Zytosol der Empfänger­zelle freigesetzt werden und dort den Stoffwechsel, Immun- oder andere Funktionen modulieren [2, 3, 5, 7]. Der genaue Mechanismus, wie diese Informationen erkannt und in die zellulären Prozesse integriert werden, muss weiter untersucht werden. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass Exosomen als Träger von endogen oder künstlich geladenen Nukleinsäuren hervorragende Leistungseigenschaften aufweisen: Sie sind im Vergleich zu anderen Trägern wie Liposomen und Nano­partikeln sowohl weniger immunogen als auch effizienter im zielgerichteten Transport [10–12].
Darüber hinaus rücken zytoplasmatische DNA-Rezeptoren wie cGAS-STING und RNA-Rezeptoren wie RIG-I, deren Downstream-Signalwege und Verbindungen mit der Imflammasom-Aktivierung, der Induktion von Zelltod und der Stimulierung der Freisetzung von Exosomen mit Antitumoraktivität in den Fokus des Interesses [13–15]. Diese Mechanismen eröffnen Möglichkeiten für die therapeutische Verwendung von Exosomen als Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten oder sogar für den gezielten Transport von Nukleinsäuren zur Behandlung von Krebserkrankungen oder für die Geweberegeneration im Herzen nach einem Herzinfarkt [5, 11, 12, 14].
Funktionsstudien haben gezeigt, dass EV wichtige Mediatoren für die Pathogenese und das Fortschreiten vieler Erkrankungen sind. Bei Krebserkrankungen können sie maligne Informationen auf benachbarte und gesunde Zellen übertragen, was zu Transformation, Progression, Invasion und Metastasierung des Tumors führt [7, 16]. Dabei sind Prozesse wie die Stimulation der Angiogenese, die Down-Regulation der Immunantwort und der „Immune Escape“ sowie das Vorbereiten einer metastatischen Nische wesentliche Schritte für die Tumor­ausbreitung. Andererseits kann die Immunaktivierung, die sich gegen den Tumor richtet, auch durch EV vermittelt werden [7, 17].
Bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen EV eine Rolle bei der Kommunikation verschiedener Zelltypen wie Herzmuskelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen. Nach hypoxischem Stress und bei Entzündungen werden sie mit verschiedenen Protein- oder RNA-Pools beladen. Sie beugen Herzschäden vor, indem sie die Apoptose abschwächen und Reparaturmechanismen fördern. Andererseits können Exosomen von Kardiomyozyten die Proliferation und Aktivierung von Herzfibroblasten fördern, was zu Fibrose und chronischem Herzversagen führt. Nach einem Myokardinfarkt zeigten Exosomen von vorstimulierten Herzvorläuferzellen ein therapeutisches Potenzial, da sie die Herzfunktion verbesserten und die Infarktgröße verringerten [5].
Auch bei anderen akuten Erkrankungen, wie Schlaganfall und Sepsis, sowie bei altersbedingten und degenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer und Parkinson, spielen EV eine Rolle bei der Begrenzung hypoxischer Schäden, der Bekämpfung von Infektionen oder der Förderung des Fortschreitens chronischer Erkrankungen.
Derzeit werden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um EV von Stammzellen zur therapeutischen Anwendung, z. B. bei zerebraler Ischämie, zu optimieren [18, 19].

Herausforderungen

Da EV heterogen und viel kleiner als Zellen sind, ist es schwierig, sie sensitiv und spezifisch in Körperflüssigkeiten, Geweben oder in funktionellen Zellkulturstudien nachzuweisen, sie zu isolieren und zu charakterisieren. Heutzutage gibt es viele methodische Ansätze für deren Isolierung, Anreicherung, Quantifizierung sowie für die EV- und zellspezifische Klassifizierung. Sie alle haben ihre Stärken und Limitationen. Es werden immer Kompromisse zwischen EV-Ausbeute und Reinheit erzielt, und die Ergebnisse von Studien hängen stark von den verwendeten Methoden ab [3, 20, 21].
Trotz des enormen Anstiegs der Veröffentlichungen im Bereich EV in den letzten zehn Jahren [22] mangelt es immer noch erheblich an Standardisierung, Datenvergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit. Dies beeinträchtigt das bessere Verständnis der Biologie und der Funktion von EV sowie die Übertragung der Ergebnisse aus der Grundlagenforschung auf die Patientenversorgung [3, 20, 21]. Internationale und nationale Gesellschaften wie die Internationale und die Deutsche Gesellschaft für Extrazelluläre Vesikel (ISEV und GSEV) wurden gegründet, um den Dialog von Wissenschaftlern, den Austausch von Forschungserfahrungen und die Entwicklung von Leitlinien für die standardisierte Erforschung von EV in der Grundlagen- und angewandten Wissenschaft zu fördern.
Eine internationale Initiative rief die Plattform EV-TRACK (EV Transparent Reporting and Centralizing Knowledgebase) ins Leben, welche eine umfassende, detaillierte und transparente Dokumentation der EV-Forschung bietet und mit EV-METRIC eine Maßzahl für die Einhaltung der Empfehlungen sowie der Vollständigkeit der Informationen in den Veröffentlichungen bereitstellt [23]. Die kürzlich aktualisierten ISEV-Richtlinien zu Mindestinformationen für Studien zu EV (MISEV) [3] sind ein konsensbasiertes Positionspapier, das die adäquate Anwendung und die präzise Dokumentation von Methoden zur Isolierung (Separation), Anreicherung (Konzentration), Quantifizierung und struktureller sowie funktioneller Charakterisierung vorgibt. Darüber hinaus erläutert es die Validierung neuer EV-assoziierter Komponenten und gibt Hilfestellung für das korrekte Durchführen von funktionellen Studien [3].
Da es schwierig ist, die Biogenese bereits freigesetzter EV zu rekonstruieren, müssen diese nach Größe, Dichte, biochemischer Zusammensetzung, (pathologischer) Bedingungen oder Ursprungszellen beschrieben und klassifiziert werden. Hierfür muss eine Mindestanzahl von Transmembran- bzw. lipidgebundenen und zytosolischen Proteinen sowie negativen Proteinmarkern bestimmt werden, um EV-Unterklassen eindeutig zu identifizieren und eine Kontamination durch Exomere, Lipoproteine oder andere große und häufig vorkommende Proteine, die nicht die typische EV- Lipiddoppelschichtmembran aufweisen, auszuschließen. Für funktionelle Studien muss auch die Topologie eines Markers außerhalb (sezerniert) oder innerhalb (luminal) der EV untersucht werden. Der Einsatz mehrerer Technologien und Standards sowie geeigneter Kontrollen wird zur Bestätigung der Ergebnisse empfohlen.

EV als Biomarker

Über die reine Quantifizierung hinaus liefern spezifische Oberflächenmarker und das Protein-, RNA- oder miRNA-Muster des Inhalts umfangreiche Informationen über die Herkunftszellen und die Funktion der EV [2, 5, 7, 9 ,21]. Wenn sie in Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Urin, Liquor, Ergüssen, Speichel usw. freigesetzt werden, können sie als neue empfindliche Biomarker dienen, da sie in spezifischen Kompartimenten angereichert sind und den biochemischen Status der Herkunftszellen widerspiegeln – auch wenn sie weit von ihnen entfernt sind.
Bei vielen Krankheitszuständen werden Tausende von EV aus einer einzelnen Zelle freigesetzt und sind in Gewebe- und Blutproben reichlich zu finden. EV können so als ideale Liquid-Profiling- bzw. Liquid-­Biopsy-Biomarkerklasse dienen: Sie übertreffen andere Kandidaten wie zirkulierende Tumorzellen (CTCs) oder zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) in Bezug auf die Sensitivität, weil diese seltener im Blut von Patienten nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann eine differenzierte Analyse von EV möglicherweise die Schwierigkeiten beim Nachweis der Heterogenität der molekularen Zusammensetzung und Funktion von Krebszellen überwinden [7, 9, 16].
EV liefern nicht nur Informationen über die erkrankten Zellen selbst, sondern auch über die Reaktion des Wirts auf diese pathologischen Zustände; z. B. durch Differenzierung von immunsuppressiven Krebs-EV und immunaktivierenden EV gesunder Zellen [17]. In ähnlicher Weise können komplexe Interaktionen wie bei der Thrombogenese durch EV widergespiegelt werden, die von Endothel-, Immun-, Herzzellen und Thrombozyten stammen. Eine umfassende Analyse der EV-Oberflächenmarker oder des vollständigen Protein- und RNA-Profils durch Omics-Technologien liefert hier wichtige Erkenntnisse [5, 6, 9, 21].
Bei Krebserkrankungen ist die EV-Konzentration stark erhöht. EV können durch Oberflächenmarker, Protein-, miRNA- und lncRNA-Muster identifiziert werden. Die Konzentration kann zur Diagnose, zur Abschätzung der Prognose und zum Monitoring von Erkrankungen verwendet werden, da sie mit dem Ansprechen der Therapie korreliert (Reviews in [7, 16]). Darüber hinaus wurde beschrieben, dass exosomales PD-L1 zur Immunsuppression beiträgt und mit einer Anti-PD-1-Reaktion assoziiert ist [24].
Ebenso wurden bei kardiovaskulären Erkrankungen (z. B. nach akutem Myokardinfarkt) kardio-spezifische miRNAs in Plasma-EV gefunden [5]. Die Analyse ist jedoch im Vergleich zu modernen hochsensitiven Troponin-Assays arbeits- und zeitaufwendig, was den diagnostischen Nutzen einschränkt. EV-Marker können jedoch für die Abschätzung der Prognose und die Aufklärung des Zusammenspiels verschiedener Zelltypen relevant sein.
Bei Sepsis und septischem Schock wird beschrieben, dass miRNAs in verschiedenen Kompartimenten wie Blutzellen, Serum und Exosomen unterschiedlich reguliert werden. Während viele untersuchte miRNAs herunter- und hochreguliert wurden, wurden einige von ihnen nur in Serum und/oder in Exosomen verändert [25]. Dies deutet darauf hin, dass zur Abschätzung der Diagnose oder Prognose das komplexe regulative Netzwerk von miRNA-Markern in verschiedenen Kompartimenten berücksichtigt werden muss.
Bemerkenswerterweise werden EV auch als Reaktion auf physiologische Veränderungen, wie z. B. stufenweise gesteigertes Fahrradfahren, in das Kreislaufsystem abgegeben. Die höchsten EV-Markerspiegel wurden bei maximaler Erschöpfung beobachtet. Verschiedene EV-Subtypen, die von Thrombozyten, Endothelzellen und Leukozyten stammen, tragen zur übungsassoziierten adaptiven systemischen Signal­gebung bei [26].
Während viele klinische EV-Biomarker-Studien vielversprechende Ergebnisse zeigen, sind viele weitere Studien erforderlich, um das Potenzial der Fülle von Biomarker-Kandidaten in diesem neuen Kompartiment für relevante klinische Fragen voll auszuschöpfen.

Akzeptanz

Voraussetzung hierfür sind jedoch eine hochqualitative Standardisierung sowie eine sorgfältige und umfassende analytische, präanalytische und klinische Validierung der Methode zur EV-Qualifizierung und -Charakterisierung (Tab. 1). 

Darüber hinaus sollte nicht vergessen werden, dass einige wesentliche Punkte für die Akzeptanz in der klinischen Routineanwendung äußerst relevant sind. Unter anderem müssen Marker und Methoden

• klinische Fragen präzise beantworten und den Workflow der Kliniker verbessern,

• sehr robust (geringe präanalytische und biologische Variabilität), zuverlässig und valide sein,

• quantifizierbar und in hohem Maße qualitätskontrolliert sein (interne und externe Systeme),

• schnell und einfach durchzuführen sein (abhängig von den Informationen und dem klinischen Bedarf) sowie

• kostengünstig und erstattungsfähig sein.

Für zukünftige weit verbreitete Anwendungen sollten sie zusätzlich

• flexibel (zur Anpassung neuer Parameter),

• skalierbar(für Automatisierung mit hohem Durchsatz),

• portabel (für Point-of-Care-Diagnostik) und

• miniaturisierbar (für mobile und „smarte“ Geräte) sein.

Fazit

Es ist offensichtlich, dass EV ein neues großes Feld für die zukünftige Erforschung der Zellbiologie, -funktion und interzellulären Kommunikation bei Gesunden und Kranken bieten. Darüber hinaus sind ihre Eigenschaften ideal für die Verwendung zur Medikamentenabgabe und bei der Impfung. Zusätzlich bieten EV eine faszinierende Plattform für die zukünftige Liquid-Profiling-Diagnostik im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten, die unser Verständnis sowohl von Erkrankungen als auch der Reaktion des Wirts revolutionieren könnte. Auch wenn noch viele Schritte erforderlich sind, bevor die EV die Patientenversorgung erreichen, ist es jetzt an der Zeit, die „EV-Goldmine“ zu erkunden.