Stolpersteine aus dem Weg räumen

Lassen sich bei einem Patienten mit einer Krebserkrankung keine Gewebeproben gewinnen oder würde die Biopsie den Patienten zu stark belasten, sind Mutationsnachweise aus der im Blut zirkulierenden Tumor-DNA zulässig und angezeigt. Diese Liquid Biopsy Assays stellen Labore vor große Herausforderungen. Präanalytik und Analytik müssen an die speziellen Anforderungen der zirkulierenden DNA angepasst werden, um die Richtigkeit der Untersuchungsergebnisse zu gewährleisten. 

Schlüsselwörter: Liquid Profiling, cfDNA, mSEPT9, VAF, Sensitivität, Spezifität

Um eine Krebserkrankung zu diagnostizieren, muss in der Regel eine Gewebeprobe entnommen (Biopsie) und histopathologisch untersucht werden. Mit der Liquid Biopsy steht nun eine minimal-invasive Technik zur Verfügung, die aus einer einfachen Blutprobe zusätzliche diagnostische Informationen generiert.

Die Liquid Biopsy wurde ursprünglich für nicht-invasive Pränataltests (NIPT) entwickelt, kommt heute aber vor allem für die Erstcharakterisierung und die Verlaufskontrolle von Tumorpatienten zum Einsatz. Dabei werden zirkulierende freie DNA und RNA (cfDNA, cfRNA), seltener zirkulierende Tumor-Zellen (CTCs) und extrazelluläre Vesikel (EV) analysiert. Als Material eignen sich nicht nur peripheres Blut bzw. Plasma, sondern zum Beispiel auch Urin, Stuhl, Pleuraflüssigkeit oder Zerebrospinalflüssigkeit. Das Ziel ist es, qualitative und quantitative Aussagen über den Tumor und etwaige Metastasen zu erhalten sowie therapierelevante Varianten  oder das Auftreten von Resistenzvarianten zu identifizieren. Diese haben bereits heute Einzug in die Routinediagnostik erhalten (Abb. 1).  

Weitere mögliche Anwendungen umfassen die Früherkennung von Tumorerkrankungen, die Überwachung des Therapieerfolgs, das Erkennen eines Rezidivs sowie die Identifikation von Resistenz-Mechanismen, die Entdeckung neuer Therapietargets und die Beobachtung der Tumorevolution. 

In der Routine wird am häufigsten cfDNA als Analyt verwendet. Im Blut stammt diese aus der Apoptose oder Nekrose normaler wie auch maligner Zellen. Während dieser zellulären Prozesse wird sie zunächst fragmentiert und später sekretiert. Ein weiterer wichtiger Anteil ist die sog. genomische DNA (gDNA), die aus aktivierten Leukozyten aktiv ausgeschüttet wird. Bei der Analyse von Tumor-DNA ist sie ein zu vermeidender Störfaktor.

Geschützt durch Nukleosomen – bestehend aus DNA und Histonen – hat cfDNA eine durchschnittliche Größe von 166 bp. Die Konzentration der cfDNA im Plasma schwankt zwischen 1 und 20 ng in 5 ml Plasma. Sie hängt von vielen individuellen Faktoren wie z. B. dem Konsum von Nikotin, entzündlichen Prozessen und dem Body Mass Index (BMI) ab. Die Tumorfraktion im Plasma (ctDNA) kann bei einer Tumorerkrankung abhängig von Stadium der Erkrankung, Lokalisation und Tumor­entität stark variieren und zwischen 0,01% bis über 90% an der cfDNA betragen.

Der erste von der U. S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Liquid Biopsy Test zur Früherkennung von Darmkrebs ist der Septin9-Test. Er weist methylierte DNA des SEPT9-Gens (mSEPT9) im Blutplasma mittels PCR nach. Das Vorliegen von mSEPT9 im Blutplasma deutet unabhängig vom Tumorstadium und der Lokalisation des Tumors auf eine Erkrankung hin. Der Test zeigt eine Sensitivität von 81% bei einer Spezifität von 99% über alle Tumorstadien und ist somit wesentlich sensitiver als die weitverbreiteten Okkultbluttests. 

Präanalytik

Um eine Freisetzung genomischer DNA durch Lyse der Blutzellen, und damit eine Kontamination mit der zirkulierenden freien DNA (cfDNA) zu verhindern, sollten die Prozesse in der Präanalytik möglichst standardisiert ablaufen. Hierbei ist insbesondere auf den Transport, die Lagerung sowie auf die verwendeten Abnahmeröhrchen zu achten. Wird EDTA-Blut als Untersuchungsmaterial verwendet, sollte möglichst spätestens vier Stunden nach der Blutentnahme mit der Isolation der cfDNA begonnen werden, da es sonst rasch zur Lyse der Blutzellen kommt. Um diesen sehr zeitkritischen Prozess zu entzerren, bieten verschiedene Hersteller spezielle Entnahmeröhrchen an, welche die Blutzellen stabilisieren sollen. Mit diesen Röhrchen lässt sich die Probe nach der Blutentnahme bis zur einer Woche bei Raumtemperatur lagern, ohne eine Veränderung in der cfDNA-Konzentration oder Varianten-Allelfrequenz (VAF) in Kauf zu nehmen [1].

Verschiedene Arbeiten haben unterschiedliche Methoden zur cfDNA-Isolation aus Plasma verglichen und gezeigt, dass die Extraktionsmethode die Ausbeute und Qualität der cfDNA beeinflussen kann. cfDNA sollte deshalb mit speziell für diesen Zweck optimierten Methoden und Kits extrahiert werden. Isolationsmethoden für gDNA können zu einem Verlust oder weiterer Fragmentierung der kurzen cfDNA-Moleküle führen. Viele der kommerziell verfügbaren Kits binden cfDNA an magnetische Beads oder Silikagel-Mikrosäulen. Die Konzentration der isolierten cfDNA wird von der Effizienz der Extraktionsmethode und dem Elutionsvolumen beeinflusst [2]. Ebenso haben die Lagerung wie auch wiederholte Ein- und Auftauzyklen einen Effekt auf die Menge der cfDNA. 

Methodenvalidierung

Nicht jede Analyseplattform ist geeignet, um cfDNA zu untersuchen: Um VAFs von 0,01% zu detektieren, sind hoch spezifische und sensitive Techniken nötig. Die Sanger-Sequenzierung erreicht beispielsweise nur eine Sensitivität von ca. 10% VAF [3]. Daher kommen vor allem Analysetechniken wie die digital-PCR, BEAMing und modifizierte Next-Generation-Sequencing-Ansätze infrage. Derzeit wird cfDNA hauptsächlich genutzt, um Punktmutationen in einem zielgerichteten Ansatz zu erfassen. Um die Richtigkeit einer Untersuchung zu gewährleisten, kann bei der Qualitätskontrolle auf die Analyse bekannter Proben zurückgegriffen werden. Diese werden entweder kommerziell erworben oder wurden bereits in einem anderen Labor analysiert. Kommerzielle Anbieter stellen gut charakterisiertes Material auf allen Ebenen des Workflows zur Verfügung (z. B. gespikte Plasmaproben, künstlich hergestellte cfDNA oder auch aus Zelllinien gewonnenes Material), welches zur Validierung der verschiedenen Arbeitsschritte im Analyseablauf genutzt werden und zusätzlich als Reaktions- und Sensitivitätskontrolle fungieren kann.

Um den Nachweis des Analyten zu prüfen, eignen sich auch weitere unabhängig validierte Methoden, Ringversuche und Laborvergleiche. Selbstverständlich müssen die Ergebnisse in Wiederholungsexperimenten reproduzierbar sein.

Viele Assays haben heutzutage eine sehr gute Spezifität von bis zu 99,9%. Die größten Schwierigkeiten der Assays bringt die Sensitivität mit, die – je nach Tumor­entität, Tumorgrad, Lokalisation und Tumorgröße – vielen tumorspezifischen Schwankungen unterworfen sind [4].

Zur Bestimmung von falsch-negativ- und falsch-positiv-Raten des Assays eignen sich vor allem Proben, die vorcharakterisiert sind, sowie kommerzielles Referenzmaterial mit niedrigen VAF, um valide Schwellenwerte für die Assays zu bestimmen. 

Nachweisgrenze

Die technische Nachweisgrenze lässt sich mit Verdünnungsexperimenten oder mit definiertem Referenzmaterial bestimmen und hängt immer von der zur Verfügung stehenden cfDNA-Menge ab: In 10 ng befinden sich etwa 3.000 humane Genom-Äquivalente, sodass für eine VAF von 1% 30 Kopien der Variante benötigt werden. Analysiert man nur 1 ng cfDNA und somit etwa 300 Genom-Äquivalente, stehen für den gleichen Nachweis von 1% VAF nur noch drei Kopien der Variante zur Verfügung (Abb. 2). Bei zu geringer cfDNA-Einsatzmenge ist die gesuchte Variante ggf. nicht mehr unter den Molekülen und kann somit nicht detektiert werden.  

Zulassung für die Diagnostik

Die Implementierung von Liquid Biopsy Assays in den Laboralltag ist nicht trivial. Nur wenige Tests besitzen eine Zulassung für diagnostische Anwendungen; in der Regel müssen die Methoden an die speziellen Anforderungen des Labors angepasst werden. Deshalb unterliegen zahlreiche Homebrew Assays nach der neuen IVD-Verordnung der Zulassungspflicht durch eine benannte Stelle. Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, ist es wichtig, Prozesse im Labor zu implementieren, die sowohl die Herstellerspezifikationen als auch deren Limitationen berücksichtigen. Die Sicherheit der Anwendung muss gewährleistet sein, um aus den Ergebnissen klinisch relevante Befunde generieren zu können.