CRISPR/Cas, das Aspirin der Gentherapie?

Die Entdeckung des mikrobiellen adaptiven CRISPR/Cas-Immunsystems und dessen Adaption als Schere zur gezielten Veränderung des Genoms in jeder beliebigen Zelle beruht auf den Arbeiten vieler Wissenschaftler aus aller Welt. Der folgende Artikel fasst die wichtigsten Beiträge und die Namen der Wissenschaftler zusammen, die dieses faszinierende Feld von der Entdeckung der CRISPR-Region im Jahre 1987 bis zur Verwendung des CRISPR/Cas-Systems zur gezielten Modifizierung der DNA in eukaryotischen Zellen im Jahre 2013 geprägt haben. Für ausführlichere historische Zusammenfassungen über dieses zukunftsträchtige Gebiet sei auf einige sehr gute Übersichtartikel verwiesen [1–5], wobei der 2016 in Cell erschienene Übersichtsartikel von Eric Lander mit dem Titel The Heroes of CRISPR, der auch als Grundlage für diese Übersicht diente, ein absolutes Muss ist. Für neuere und zukünftige Anwendungsmöglichkeiten wird auf einen früheren Artikel in Trillium Immunologie [6] und auf weitere Beiträge in dieser Trillium-Ausgabe verwiesen. In Tabelle 1 sind die wichtigsten Abkürzungen zusammengefasst.

Der Beginn – Entdeckung der Funktion des CRISPR-Lokus

Die CRISPR-Geschichte beginnt 1987 in Japan. Die Arbeitsgruppe um Atsuo Nakata an der Osaka-Universität entdeckte während der Analyse des Iap-Gens aus Escherichia coli (E. coli) zufällig ein Cluster von sich wiederholenden, etwa 30 Nukleotide langen identischen Sequenzen, die durch kurze variable Bereiche (später „Spacer“ genannt) getrennt waren [7, 8]. Die sich wiederholenden Bereiche enthalten palindromische (sich spiegelbildlich wiederholende) Sequenzen. Diese Entdeckung setzte eine anfänglich eher Hypothesen-freie und auf Prokaryonten fokussierte Forschungsphase in Gang. Diese hatte ihren Höhepunkt mit den im Jahre 2012 publizierten Entdeckungen, dass für das CRISPR-vermittelte Schneiden eines doppelsträngigen DNA-Fragments in vitro nur eine mit dem CRISPR-Lokus assoziierte DNA-Nuklease, das sogenannte Cas9-Protein, und zwei kurze in der CRISPR-Region kodierte einzelsträngige RNA-Stränge, die sogenannte CRISPR-RNA, kurz crRNA, und die trans-activating crRNA, kurz tracrRNA, notwendig waren [9, 10]. Im Gegensatz zu einem klassischen Restriktionsenzym wird der Ort des Schnitts in der doppelsträngigen Ziel-DNA nicht vom Cas9-Protein, sondern von der in der Reaktion verwendeten crRNA-Sequenz bestimmt. Es handelt sich bei Cas9 also um eine über crRNA programmierte Endonuklease (Abb. 1A).

CRISPR/Cas – das bakterielle Nukleinsäure-basierte adaptive Immunsystem

Die Hypothese, dass es sich bei dem CRISPR/Cas-System tatsächlich um eine Art adaptive bakterielle Immunabwehr gegen fremde DNA handelt, wurde 2007 von Rodolphe Barrangou und Philippe Horvath und Kollegen von der Firma Danisco in Madison (USA) und Frankreich, experimentell bestätigt. Die Lebensmittelfirma Danisco war da­ran interessiert, die Infektion der für die Joghurt-Produktion verwendeten Bakterienkulturen durch Bakteriophagen zu verhindern. Diese Untersuchungen zeigten, dass Bakterien, die während einer Phagen-Infektion kleine Teile des Virus in ihre Spacer-Region zwischen die repetitiven CRISPR-Elemente integriert hatten, genau gegen diesen Phagen, aber nicht gegen andere Phagen resistent waren. Eine über rekombinante Methoden vermittelte Insertion synthetischer viraler Sequenzen in die Spacer-Region von Phagen-sensiblen Bakterienstämmen führte ebenfalls zur Immunität. Auch konnten Barrangou und Horvath in Mutationsexperimenten zeigen, dass für die Etablierung der adaptiven Immunität CRISPR-assoziierte Gene, wie Cas9, notwendig waren [21].
Die über den CRISPR/Cas-Mechanismus integrierte virale Sequenz und die damit erworbene Immunität gegen bestimmte Phagen oder Plasmide kann bei der Zellteilung eines Bakteriums auf die Nachkommen übertragen werden. Koonin und Kollegen schlugen deshalb vor, dass es sich beim CRISPR/Cas-System um eines der seltenen Beispiele einer klassischen Vererbung nach Lamarck handelt [22, 23].

Die Komponenten des bakteriellen CRISPR/Cas-Systems

Innerhalb der nächsten 5 Jahre wurden die wichtigsten für die CRISPR-Immunität notwendigen Faktoren und Mechanismen aufgeklärt. Im August 2008 konnte die Gruppe von John van der Oost an der Universität Wageningen in den Niederlanden zeigen, dass einige der in E. coli vorhandenen Cas-Proteine für die Prozessierung einer vom CRISPR-Lokus transkribierten Vorläufer-RNA in eine reife 61–nt lange CRISPR-RNA (crRNA) notwendig ist. Die reife crRNA bestand aus dem Ende der stromaufwärts gelegenen repetitiven Sequenz, der gesamten Spacer-Region und dem Beginn des nächsten Repeats [24]. Durch Insertion von am Computer entworfenen „Anti“-λ-Phagen-CRISPR-Sequenzen in den CRISPR-Lokus des bakteriellen Genoms konnten sie klar zeigen, dass die Bildung von reifen Leit (Englisch: guide)-crRNAs durch Cas-Proteine eine mechanistische Voraussetzung für die antivirale Abwehr (in ihrem Fall gegen λ-Phagen) ist.
Vier Monate später konnten Luciano Marraffini und Erik Sontheimer in Chicago (USA) in einem wirklich genialen Experiment mit Plasmiden, die in ihrer CRISPR-Zielsequenz ein selbstspleißendes Intron enthielten, zeigen, dass DNA und nicht RNA die Zielstruktur des CRISPR-Systems ist [25]. Beide Forscher erkannten, dass CRISPR nichts anders als ein programmierbares Restriktionsenzym ist, dessen Spezifität durch die in der Reaktion verwendete crRNA bestimmt bzw. programmiert wird (siehe dazu S. 23, 1. Paragraph in Referenz [4]). Sie sahen auch als Erste eine mögliche Verwendung dieses Systems zur Genmodifikation außerhalb seiner natürlichen bakteriellen Umgebung. Laut Eric Lander wurde zwar ein Patent angemeldet, aber aufgrund fehlender experimenteller Daten von den beiden Forschern nicht weiterverfolgt [4].
Es dauerte zwei Jahre, bis die Gruppe um Sylvain Moineau von der Universität Quebec (Kanada) zusammen mit Kollegen von der Firma Danisco in dem Bakterienstamm Streptococcus thermophilus nachweisen konnte, dass die Endonuklease Cas9 für das Schneiden fremder DNA notwendig ist [26]. Die Cas9-Endonuklease schneidet dabei in der zur crRNA komplementären Zielsequenz, der sogenannten Protospacer-Region, genau drei  Nukleotide stromaufwärts von dem von Bolotin beschriebenen Protospacer-Adjacent Motif, kurz PAM [19] und erzeugt einen Doppelstrangschnitt mit stumpfen Enden (Abb. 1A). Diese Befunde zeigten klar, dass die Position, an der die Endonuklease Cas9 den Doppelstrangschnitt in der Zielsequenz setzt, von der spezifischen Sequenz der guide crRNA bestimmt wird.
Die in der Spacer-Region des Bakteriengenoms kodierte crRNA identifiziert ihre Zielsequenz, d. h., die Protospacer-Region, z. B. in invasiven Viren durch direkte Watson-Crick-Paarung (Abb. 1A). Wie eine crRNA es aber vermeidet, ihre „eigene“ Spacer-DNA innerhalb des CRISPR-Lokus anzugreifen, war ein Rätsel. Dieses Problem wurde 2010 von Marraffini und Sontheimer gelöst [27]. Die beiden Forscher konnten zeigen, dass die von Bolotin in direkter Nachbarschaft des viralen Protospacers entdeckte PAM-Sequenz dafür verantwortlich ist (Abb. 1A). Interessanterweise fehlen diese PAMs in den Spacer-Regionen des CRISPR-Lokus. Dies erlaubt dem CRISPR-System zwischen der eigenen Spacer-Region und der identischen Protospacer-Zielregion in Viren und Bakterien und somit in Analogie zum adaptiven Immunsystem von Wirbeltieren zwischen Selbst und Nicht-Selbst zu unterscheiden [27].
2011 entdeckten die Arbeitsgruppen um Jörg Vogel von der Universität Würzburg und Emmanuelle Carpentier von der Universität Umeå, Schweden, eine weitere CRISPR-RNA, die sogenannte trans-activating crRNA, kurz tracrRNA [28]. Eine genomweite Transkriptom-Analyse von Streptococcus pyogenes mittels der gerade etablierten Next Generation-Sequenziertechnik identifizierte die tracrRNA als eine der am häufigsten exprimierten RNAs. Interessanterweise befand sich das Gen für die tracrRNA gleich neben dem CRISPR-Lokus (Abb. 1A). Zudem zeigte ein Teil ihrer Sequenz eine fast perfekte Übereinstimmung mit repetitiven CRISPR-Sequenzen in crRNAs. Vogel und Charpentier bestätigten experimentell, dass die tracrRNA nach der Hybridisierung mit der Vorläufer-crRNA und somit für die CRISPR-Aktivität notwendig ist.
Für einen spezifischen Schnitt in einer doppelsträngigen (ds) DNA benötigt man also nicht nur die Endonuklease Cas9, sondern auch zwei kleine im CRISPR-Lokus kodierte CRISPR-RNAs: die tracrRNA, die für die Reifung der crRNA notwendig ist, und die crRNA, die Cas9 an ihren spezifischen Schnittpunkt dirigiert. Die crRNA programmiert somit die Spezifität der Effektor-Endonuklease Cas9. CRISPR-Komplexe, bestehend aus der Cas9-Endonuklase und crRNAs, sind also wie klassische Antiköper magische Kugeln mit dualen Funktionen: Sie erkennen Eindringlinge über ihre „magische“ crRNA-Komponente und eliminieren fremde DNA über ihren Kugelteil, die Cas9-Endonuklease (Abb. 2).

Die „Minimalisierung“ des CRISPR/Cas-Systems

Die Gruppen um Jennifer Doudna an der Universität von Kalifornien in Berkeley, USA, und Emmanuelle Charpentier an der Universität Umeå, Schweden ([9], publiziert am 17. August 2012), sowie die Gruppe um Virginijus Siksnys von der Universität Vilnius, Litauen ([10], publiziert 3. September 2012) zeigten in vitro, dass Cas9 und zwei CRISPR-RNAs, die crRNA und die tracrRNA, ausreichend sind, um DNA spezifisch an einer über die crRNA-Sequenz vorhergesagten Stelle zu schneiden. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass das Journal Cell das von Virginijus Siksnys eingereichte Manuskript am 6. April 2012 nach nur sechs Tagen ohne externe Begutachtung ablehnte.

CRISPR/Cas-vermittelte Genmodifikation in eukaryotischen Zellen

Beide Gruppen spekulierten, dass das CRISPR-System als „RNA-programmierte Cas9-Methodik“ (Doudna und Charpentier) bzw. mittels einer „RNA-gesteuerten DNA-Chirurgie“ (Siksnys) auch außerhalb eines Prokaryonten zur gezielten Gen-Mutation verwendet werden kann. Nur wenige Monate nach dieser zukunftsweisenden Hypothese konnten folgende vier Forscherteams unabhängig voneinander in kurzen Abständen zeigen, dass mittels Transfektion von Cas9 zusammen mit entweder einer spezifischen crRNA und tracrRNA oder nur einer einzelnen crRNA-tracrRNA-Hybrid-guide-RNA, kurz single guide (sg) RNA genannt (siehe Abb. 1B), die Genom-Editierung in Säugetierzellen möglich ist: Jennifer Doudna ([29], veröffentlicht im Januar in eLife), George Church an der Havard Universität in Boston ([30], veröffentlicht im Februar in Science), Feng Zhang am Broad-Institut am MIT in Bosten ([31], veröffentlicht im Februar in Science) und Jin-Soo Kim an der Seoul National University in Südkorea ([32], veröffentlicht im März in Nature Biotechnology).

Nobelpreis(e)?

Eigentlich wartet die Fachwelt seit 2013, auch als AC 1 (Anno CRISPR 1 [1]) bezeichnet, dass die Entdeckung des CRISPR/Cas-Systems als bakterielles Abwehrsystem gegen fremde DNA sowie seine Anwendung als hochspezifische Genschere in Eukaryonten mit dem Nobelpreis für Physiologie und Medizin oder Chemie ausgelobt wird. Laut Alfred Nobel, dem Gründer der Nobel-Stiftung, soll nicht ein Lebenswerk, sondern die Aktivität, Forschung oder Entdeckung honoriert werden, die im vergangenen Jahr der Menschheit am meisten Nutzen brachte. Das trifft wahrscheinlich häufig für die Verleihung des Friedensnobelpreises zu. Die Verleihung des Physiknobelpreises im Jahre 1987 an Karl Alex Müller und Johannes Georg Bednorz für die ein Jahr zuvor publizierte Entdeckung des keramischen Hochtemperatursupraleiters sind im naturwissenschaftlichen und medizinischen Bereich eher die Ausnahmen [33]. Um Wissen beispielsweise aus der naturwissenschaftlichen Grundlagenforschung in die Klinik zum Nutzen der Menschheit zu übertragen, braucht es meistens einige Jahre.
Dennoch möchte man hier doch ein wenig über mögliche Nobelpreis-Kandidaten möglichst ohne Wertung für oder gegen den einen oder die andere spekulieren. Pro Jahr dürfen laut Statuten der Nobel-Stiftung maximal drei Personen für denselben Nobelpreis geehrt werden [34]. Falls man im gleichen Jahr für die CRISPR-Cas-Entdeckung die Preise für Medizin und Chemie vergeben würde, könnten maximal sechs Forscher zu diesen Ehren kommen. Welche Kandidaten würden hier infrage kommen? Ist es Mojica, der als erster gezeigt hat, dass CRISPR-Motive im Prokaryonten-Reich weit verbreitet sind und dass die Abstände (oder Spacer) zwischen den sich wiederholenden Sequenzen im CRISPR-Lokus viralen Ursprungs sind? Oder sind es Barrangou und Horvath, die 2007 zeigen konnten, dass das CRISPR/Cas-System die Grundlage für eine adaptive Immunität von Bakterien gegen Viren bildet? Auch die von den Gruppen um Doudna und Charpentier [9] und von Siksnys aus Vilnius [10] fast gleichzeitig veröffentliche Entdeckung, dass man in vitro für den spezifischen DNA-Doppelstrangschnitt nur die Cas9-Nuklease und zwei kleine CRISPR-RNAs benötigt, ist preisverdächtig. Und die vier Gruppen von Doudna [29], Church [31], Feng [30] und Kim [32], die 2013 im Abstand von drei Monaten unabhängig voneinander zeigen konnten, dass das bakterielle CRISPR-System zur Genmodifikation in Säugetierzellen verwendet werden kann, müssen ebenfalls diskutiert werden. Und ohne die Identifizierung der am CRISPR-Mechanismus beteiligten Komponenten, z. B. in den Laboren von Luciano Marraffini in Chicago, John van der Oost in den Niederlanden, Sylvain Moineau in Quebec und Jörg Vogel in Würzburg, wäre die Translation der Befunde von Bakterien in Säugetierzellen nicht möglich gewesen [24–26, 28, 35].
Falls der Nobelpreis für das CRISPR-System dann mal vergeben wird, darf man gespannt sein, wer die „Gewinner“ sind. Vielleicht wartet man ja dieses Mal ab, ob getreu den Statuten des Stifters Alfred Nobel diese wunderbare Entdeckung tatsächlich direkt zum Nutzen der Menschheit als neuer Ansatz zur Dia­gnostik und Therapie bisher unheilbarer Krankheiten einsetzbar ist. Dies scheint unter Berücksichtigung, dass das CRISPR/Cas-System bereits erfolgreich zur Genmutation von Labortieren und Pflanzen verwendet wird, nur eine Frage der Zeit zu sein [36].