Resistenztestung in der Mikrobiologie: Phänotypische und genotypische Ansätze

Als Krankheitserreger entwickeln Bakterien immer häufiger mindestens eine Resistenz gegen gängige Antibiotika. Die Ursachen dafür sind vielfältig: Sie reichen von Spontanmutationen und Gentransfer im Rahmen der natürlichen Evolution über die gezielte Begünstigung der Resis­tenzentwicklung durch übermäßigen Einsatz von Antibiotika beim Menschen und in der Nutztierhaltung bis hin zur weltweiten Verbreitung resistenter Bakterien durch die Globalisierung.

Drei molekulare Mechanismen der Resis­tenzentwicklung stehen im Vordergrund:

1. Veränderungen von Zielstrukturen auf der Zellmembran senken die Affinität von Antibiotika.
2. Effluxpumpen transportieren Antibiotika gezielt aus der Zelle hinaus.
3. Hydrolytische Enzyme bauen Antibiotika ab.

In die erste Gruppe fallen beispielsweise Vancomycin-Resistenzen durch Modifikation von Peptidoglykan-Vorstufen für die Synthese der Bakterienzellwand. Die zweite Gruppe umfasst zahlreiche Moleküle mit exotischen Namen wie AcrAB-TolC oder MexAB-OprM, die β-Lactame und Chinolone aus Escherichia coli bzw. Pseudomonas aeruginosa hinausbefördern.

Am bedeutsamsten für die Resistenz­testung sind derzeit die β-Lactamasen, die in der Lage sind, β-Lactam-Antibiotika wie Penicilline, Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme wirkungslos zu machen. Dagegen können β-Lactamase-Inhibitoren wie etwa die Clavulansäure eingesetzt werden, die keine direkt antibiotische Wirkung haben, sondern β-Lactam-Antibiotika vor dem enzymatischen Abbau schützen.

Verfahren der Resistenztestung

Die Antibiotika-Resistenz von Bakterien kann mithilfe verschiedener Laborverfahren erkannt und quantifiziert werden. Sie lassen sich in erster Linie in phänotypische und genotypische Ansätze unterteilen. Zunehmend kommen auch Nachweise von resistenzvermittelnden Proteinen mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Immunoassay zum Einsatz.

Die phänotypische Resistenzbestimmung ist nach wie vor der Goldstandard, da nur mit diesem Verfahren gesichert werden kann, dass die Resistenzgene auch tatsächlich in ausreichendem Maße exprimiert werden. Die Bakterien werden auf einer Agarplatte ausgestrichen und mit Anti­biotika-getränkten Papierscheiben inkubiert. Der Hemmhof um die Scheiben wird ausgemessen und für eine semiquantitative Auswertung (sensibel, intermediär, resistent) mit Standards verglichen. Das manuelle Verfahren ist arbeits- und zeitaufwendig, kann aber weitgehend automatisiert und computergestützt ausgewertet werden.

Für die quantitative Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) kultiviert man die Bakterien in flüssigen Medien mit unterschiedlichen Antibiotika-Konzentrationen (Mikrodilutionstest) oder legt Teststreifen mit einem Konzentrationsgradienten des Antibiotikums auf eine Agarplatte mit der Bakterienkultur.

Molekularbiologische Verfahren

Deutlich schneller sind genotypische Ansätze, in deren Rahmen das langwierige Anlegen der Kultur entfällt. Ihr Nachteil ist aber, wie bereits gesagt, dass der molekularbiologische Nachweis eines resistenzvermittelnden Gens keine Aussage über dessen Expression und somit biologische Wirksamkeit erlaubt.  Von Vorteil ist, dass die Tests auch bei bestehender Vorbehandlung mit Antibiotika durchgeführt werden können.

Das älteste und nach wie vor wichtigste Verfahren der genotypischen Resistenztestung ist die PCR. Die ersten molekularbiologischen Verfahren erfassten MRSA mittels Einzel-PCR auf das Resistenzgen mecA. Im Laufe der Zeit wurden jedoch immer mehr Methicillin-Resis­tenz-vermittelnde Gene bekannt, und seit einigen Jahren sind vor allem auch multiresistente gramnegative Erreger mit Resis­tenzen gegen ganze Antibiotika-Gruppen auf dem Vormarsch. Deshalb wird Multiplexing in der PCR-Diagnostik heute immer mehr zum Standard. Voll­automatische Kartuschensysteme erlauben den Einsatz am Point of Care, was der PCR insbesondere während der Coronavirus-Pandemie eine enorme Popularität eintrug.

Neuere molekularbiologische Verfahren sind das Next Generation Sequencing (NGS) für eine umfassende Analyse des bakteriellen Genoms mit allen potenziellen Resistenzgenen, die DNA-Microarray-Technologie, die eine nukleinsäurebasierte Expressionsanalyse ermöglicht, sowie neuerdings die CRISPR-basierte Analytik zur spezifischen und hochsensitiven Erkennung von Resistenzgenen mithilfe von lichtstarken Fluoreszenzmarkern.

Häufig werden genotypische und phänotypische Methoden kombiniert, um das Beste aus beiden Welten zu nutzen: schnelle Ergebnisse mit vollautomatischer Durchführung plus sichere Aussagen über die klinische Relevanz der detektierten Resistenzen. Letztlich hängt die Wahl der Methode immer von der Fragestellung ab, beispielsweise PCR für die Notfalldiagnostik, Agardiffusion und Mikrodilution für die Routine und NGS für die Forschung

Dr. Gabriele Egert
Prof. Dr. Georg Hoffmann
Mitglieder der Redaktion