Umfassende Information in einem Arbeitsgang

Das Next Generation Sequencing eignet sich hervorragend für den Nachweis von Genfusionen im molekular-pathologischen Routinelabor. Die Technik ist – bezogen auf die gleichzeitig abzudeckenden Fusionsereignisse – schnell, relativ kostengünstig und erfasst je nach Probenvorbereitung auch bisher unbekannte Fusionspartnergene.
Schlüsselwörter: Fusionsgene, NGS, Genomsequenzierung, Transkriptomsequenzierung, Panelsequenzierung

Genfusionen treten infolge chromosomaler Rearrangements auf und stellen einen wichtigen Mechanismus der Tumorgenese und -progression dar. Hierbei kommt es durch Umlagerung der DNA zu neuen Kombinationen von Genen und/oder regulatorischen Elementen, die zu einer unphysiologischen Aktivierung oder Inaktivierung funktionell relevanter Gene führen.
Historisch wurden zuerst chromosomale Aberrationen beschrieben, da mithilfe der klassischen Zytogenetik und Anfärbung der chromosomalen Bänderung nur größere interchromosomale Translokationen detektiert werden konnten. Ein klassisches Beispiel hierfür ist das bereits 1960 bei chronischer myeloischer Leukämie beschriebene Philadelphia Chromosom^[1], ein Fusionsgen, das durch eine balancierte (9;22)(q34;q11)-Trans­lokation entsteht und nach der Translation als chimäres BCR-ABL-Fusionsprotein onkogen wirkt.
Der Nachweis spezifischer und rekurrenter Genfusionen spielte in der Vergangenheit vor allem bei der Diagnostik von hämatologischen Neoplasien und Weichteiltumoren eine Rolle, da solche Fusionen teilweise hochspezifisch für bestimmte Entitäten sind. Bei soliden Tumoren rückte ihr Nachweis als therapeutisches Target mit der Entdeckung der EML4-ALK-Fusion im Jahr 2007 beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom vermehrt in den Fokus^[2]. Durch die Hochdurchsatzsequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) ist es heute möglich, auch völlig unbekannte Genfusionen zu detektieren, sodass in den letzten Jahren zahlreiche neue – sowohl diagnostisch als auch potenziell therapeutisch interessante – Varianten in soliden Tumoren beschrieben wurden.

Herkömmliche Verfahren
Nachweise von Genfusionen in der molekular-pathologischen Routinediagnostik mit diagnostischer oder therapeutischer Fragestellung werden häufig an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Material (FFPE) durchgeführt. Die Methoden müssen trotzdem stabil funktionieren, wenig zeitaufwendig und kostengünstig sein. Hier hat sich in der Vergangenheit der Nachweis auf DNA-Ebene mittels spezifischer Fluoreszenz-markierter Gensonden (FISH), oder in speziellen Fragestellungen auf RNA-Ebene mittels RT-PCR bewährt. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch der geringe Durchsatz, da für jede potenzielle Genfusion eine eigene FISH-Sonde bzw. RT-PCR etabliert, durchgeführt und ausgewertet werden muss.
Zudem ist die FISH-Auswertung von Genfusionen infolge kurzer intra-chromosomaler Deletionen/Inversionen wie zum Beispiel der EML4-ALK-Fusion mit einer nur zwölf Megabasen großen Inversion am kurzen Arm von Chromosom 2 teilweise schwierig durchzuführen, erfordert viel Erfahrung und ist zeitaufwendig. Nicht zuletzt fehlen beim Nachweis einer Genfusion mittels FISH-Sonde bei den häufig verwendeten sogenannten Break-apart-Sonden Informationen über das 5´-Partner-Gen und die Fusionsvarian­te. Die exakte Kenntnis genau dieser Variante einer Genfusion hat jedoch möglicherweise prognostische^[3] oder therapeutische Bedeutung[4].

Next Generation Sequencing
Beim Nachweis einer Genfusion mittels NGS liegen genau diese Informationen vor, da über die Sequenzierung des Bruchpunktes und der benachbarten Bereiche die beiden beteiligten 5´- und 3´-Gene sowie die exakte Fusionsvariante bestimmt werden können.
Bei dieser Technik wird aus DNA (oder RNA/cDNA bei der reversen Transkriptasereaktion) zunächst eine Bibliothek erstellt, die dann hochparallel sequenziert wird. Das Besondere ist dabei, dass die erzeugten Sequenzen tatsächlich auf einzelne DNA-Moleküle zurückzuführen sind, die vorher klonal vermehrt wurden. Da die zu untersuchenden Abschnitte des Genoms bzw. Transkriptoms hochparallel, sprich bis zu mehrere tausend Male ausgelesen werden, erhält man ein hohes Maß an Sensitivität für alle Nukleinsäurevarianten, die in einer Probe vorliegen.
NGS ist in der Molekularpathologie inzwischen bereits als Methode zum Nachweis von Punktmutationen oder kleinen Deletionen und Insertionen der DNA in Tumoren gut etabliert. Als erfolgreiches Beispiel hierfür sei der Nachweis von Mutationen der Gene BRCA1 und BRCA2 beim Ovarialkarzinom genannt: Er bildet die Grundlage für eine Therapie mit einem PARP-Inhibitor.

Einsatz auf DNA- und RNA-Ebene
NGS eignet sich aber auch hervorragend für den Nachweis von Genfusionen, wobei grundsätzlich sowohl DNA als auch RNA als Ausgangsmaterial verwendet werden können. Auf der DNA-Ebene weist man den tatsächlichen Bruchpunkt zwischen zwei Genen nach; auf der RNA-Ebene wird dagegen das Aneinanderspleißen von zwei Exonen unterschiedlicher Gene detektiert, was indirekt die Genfusion belegt.
Ein Nachteil des Nachweises auf DNA-Ebene ist die teilweise große Variabilität der Bruchpunkt-Region, weshalb man  dafür große Sequenzierkapazität einplanen muss. Auf der RNA-Ebene reduziert sich die Variabilität erheblich, sodass sich durch das Spleißen der mRNA der Nachweis auf die beteiligten Exone beschränken kann. Ein wesentlicher Vorteil ist hier die größere Menge an Zielmolekülen in einer Probe. Während eine Tumorzelle in der Regel nur eine einzige Genkopie mit dem Fusionsereignis aufweist, wird dieses auf mRNA-Ebene in jeder Zelle bis zu mehreren Tausend Mal transkribiert.
Großformatige Sequenzierungen
Beim Whole Genome Sequencing (WGS, „Ganzgenom-Sequenzierung“) werden alle rund drei Milliarden Basenpaare des Genoms sequenziert, bei der Transkriptom-Sequenzierung (RNA-Seq) die gesamte abgelesene mRNA. Durch diese großformatigen Sequenzanalysen können auch völlig neue, bisher unbekannte Gen­fusionen detektiert werden, da die komplette Nukleinsäure untersucht wird[5] (siehe Abb. 1). Diese Untersuchungs­ansätze sind jedoch in der Regel zu aufwendig und zu teuer für die molekular-pathologische Routinediagnostik, haben jedoch einen festen Stellenwert in der Forschung, beispielsweise bei der Charakterisierung neuer Tumorentitäten oder im Rahmen übergreifender Forschungsprojekte wie etwa dem The Cancer Genome Atlas (TCGA).

Großformatige Sequenzierungen
Beim Whole Genome Sequencing (WGS, „Ganzgenom-Sequenzierung“) werden alle rund drei Milliarden Basenpaare des Genoms sequenziert, bei der Transkriptom-Sequenzierung (RNA-Seq) die gesamte abgelesene mRNA. Durch diese großformatigen Sequenzanalysen können auch völlig neue, bisher unbekannte Gen­fusionen detektiert werden, da die komplette Nukleinsäure untersucht wird^[5] (siehe Abb. 1). Diese Untersuchungs­ansätze sind jedoch in der Regel zu aufwendig und zu teuer für die molekular-pathologische Routinediagnostik, haben jedoch einen festen Stellenwert in der Forschung, beispielsweise bei der Charakterisierung neuer Tumorentitäten oder im Rahmen übergreifender Forschungsprojekte wie etwa dem The Cancer Genome Atlas (TCGA).

Panelsequenzierung
Eine kostengünstige und schnelle Möglichkeit, Genfusionen in FFPE-Material mittels NGS nachzuweisen, ist die Panel-Sequenzierung, bei der bis zu hundert verschiedene Genfusionen in einer Probe gleichzeitig untersucht werden können. Im Gegensatz zur Sequenzierung ganzer Genome oder Transkriptome werden hier aber vor der Sequenzierung nur bestimmte Bereiche der zu analysierenden Nukleinsäure angereichert und dann sequenziert. Die Anreicherung kann dabei zum einen über Sonden erfolgen, die über eine Hybridisierung aus der Tumor-Probe nur die benötigten DNA/RNA-Abschnitte „herausfischen“, oder über eine vorgeschaltete Multiplex-PCR zur Amplifikation der gewünschten Bereiche (Abb. 2).
Bei der nachfolgenden Sequenzierung können bei einer solchen Multiplex-PCR mehrere hundert bis tausend verschiedene Amplikons gleichzeitig amplifiziert werden, die man dann bioinformatisch aufarbeitet. Je nach Methode werden dabei nur Fusionen aus bereits bekannten Partnergenen detektiert.
Alternativ kann man aber auch Gen-spezifische Primer am 3´-Gen (z. B. ALK) einsetzen, während das (möglicherweise noch unbekannte) 5´-Partnergen über einen generalisierten Primer erkannt und amplifiziert wird.
Fusionsgene weisen häufig eine Imbalanz der Expression von 5´- und 3´-Re­gionen der mRNA auf, da in der Regel nur der im Fusionsgen vorhandene Teil abgelesen wird. Und weil die Anzahl der mit NGS erzeugten Sequenzen für ein bestimmtes Amplikon innerhalb einer Multiplex-PCR in der Regel sehr stabil ist, können über die sogenannte 5´-3´-Imbalanz, also die verschobene Anzahl von Sequenzen (Reads) der 5´- und 3´-Bereiche eines Gens ebenfalls indirekt Genfusionen nachgewiesen werden^[6]. Die bioinformatische Analyse und Interpretation der erzeugten Sequenzierdaten stellt einen wesentlichen Teil der Untersuchung dar und muss auf die jeweils verwendete Methode der Anreicherung zugeschnitten sein. Inzwischen existieren zahlreiche Bioinformatiklösungen verschiedener Anbieter, die auf den gängigen Sequenzierplattformen verwendet werden können.