Liquid Biopsy in Forschung und Routine

Automatisierte Nukleinsäure-Extraktion mit dem QIAsymphony

Die LifeCodexx AG entwickelt innovative molekulare Untersuchungsverfahren. Der PraenaTest^® erkennt chromosomale Aberrationen des Fötus aus dem mütterlichen Blut. Für die automatisierte Isolierung von zirkulierender fetaler DNA kommt das QIAsymphony-System zum Einsatz.

Ein Biomarker aus dem Blut, der über molekulare Zielstrukturen einer individualisierten Therapie, Treibermutationen maligner Tumoren oder den Gesundheitszustand des Fötus während einer Risikoschwangerschaft Auskunft gibt: Solch unterschiedliche Aussagen verspricht die Analyse von zirkulierender, zellfreier DNA (ccfDNA) aus dem Blut.

Liquid Biopsy
Entsprechend begeistert feiern manche Autoren das Potenzial der „Liquid Biopsy“ als Beginn einer Revolution bei der Erkennung kritischer Situationen, die sich herkömmlicher Labordiagnostik bislang entziehen. In der Onkologie sowie bei sogenannten Companion Diagnostics (CDx) setzen Pharma- und Biotechnologieunternehmen diese Technologie bereits zur Suche nach neuen Medikamenten oder im Rahmen von klinischen Studien für das Therapiemonitoring ein. Seit Längerem hat sich die Analyse von Liquid Biopsy-Proben in der humangenetischen Pränataldiagnostik bewährt. Die nicht-invasive Pränataldiagnostik (NIPT) macht sich zunutze, dass die ccfDNA im Blut der Mutter zu ca. 2–40% (im Mittel etwa 10%) aus DNA fetalen Ursprungs besteht.

Der PraenaTest^®
Die LifeCodexx AG aus Konstanz am Bodensee entwickelt seit 2010 innovative diagnostische Tests auf der Basis molekularer Analyseverfahren und hat mit dem PraenaTest^® einen nicht-invasiven Pränataltest zur Marktreife geführt. Für diesen Test wird aus dem maternalen Blut fetale ccfDNA gewonnen und auf Chromosomenaberrationen wie zum Beispiel die Trisomien 13, 18 und 21 (Down Syndrom) oder Klinefelter-, Turner-, Triple X- und XYY-Syndrom untersucht. Dazu wurden bei der LifeCodexx AG komplexe und auf der Next Generation Sequencing-Technologie basierende Arbeitsabläufe entwickelt und für Routineanwendungen etabliert.

Das Ziel der LifeCodexx AG
Die fetale ccfDNA macht im Schnitt ca. 10% der gesamten ccfDNA aus; es geht also um ein bis zehn Nanogramm kurzer DNA-Fragmente pro ml Blut, die bei einer Halbwertszeit von weniger als einer Stunde rasch, reproduzierbar und in hoher Qualität extrahiert werden müssen. Drei Jahre nachdem der Test die Marktreife erlangt hat ist das Bestreben groß, alle Prozesse für die Aufarbeitung von Liquid Biopsy-Proben durch Automatisierung zu standardisieren, um optimale Ausbeuten bei konstant hoher Qualität zu erzielen.

Die Herausforderung für QIAGEN
Qiagen bietet mit dem QIAsymphony-System eine bewährte Automations-Plattform mit einer Vielzahl von individualisierten Protokollen für Forschung und Diagnostik an. Die Herausforderung liegt in der Entwicklung eines Protokolls für den QIAsymphony, mit dem fetale ccfDNA aus dem Blut Schwangerer in einer ausreichend hohen Menge und voll automatisiert extrahiert werden kann. Diese fetale ccfDNA muss in ihrer Zusammensetzung, der Größenverteilung und Reinheit dem Ergebnis nach der etablierten manuellen Aufreinigung entsprechen und in den nachgeschalteten Analyseverfahren gleiche oder sogar bessere Ergebnisse liefern.

Die Vorbereitung
Qiagen führte bereits im Jahr 2009 ein Kit für die manuelle Gewinnung von ccfDNA im Markt ein. Ein entsprechendes Protokoll wurde jetzt für den QIAsymphony auf der Basis der Magnetpartikeltechnologie entwickelt, sodass das ursprünglich manuelle Verfahren mit dem neuen automatisierten Protokoll verglichen werden konnte. Aus 96 Proben mit bis zu 4 ml Plasma konnten innerhalb von sechs Stunden exzellente Ausbeuten erzielt werden.

Ergebnisse
Die Analyse von extrahierten ccfDNA-Proben aus 12 gesunden Spendern mit einem High Sensitivity DNA-Chip der Firma Agilent ergab eine maximale Größenverteilung von bis zu 180 bp, was der Länge eines Nucleosoms entspricht. Die Quantifizierung erfolgte mit einem fluorimetrischen Assay in einem Qubit®-Fluorometer und ergab im Mittel 0,3 ng/µl ccfDNA je Eluat. In zusätzlichen Realtime-PCR-Experimenten mit dem QIAGEN QuantiTect® Multiplex PCR-Kit wurden vergleichend kurze Abschnitte aus ccfDNA-Eluaten nach manueller Aufreinigung (rot) und nach Extraktion auf dem QIAsymphony (blau) amplifiziert. Die als Zielkopien je ml Plasma (cps/ml) kalkulierten Ausbeuten lagen in der automatisierten Version um durchschnittlich 25% höher (siehe nachfolgende Abbildung).

Die Extraktion auf dem QIAsymphony (blau) liefert im Vergleich zur manuellen Methode (rot) höhere ccfDNA-Ausbeuten.

Die Extraktion auf dem QIAsymphony erhöht den fetalen Anteil in ccfDNA-Eluaten.

In einer weiteren Serie von Experimenten mit maternalem Plasma ermittelte die LifeCodexx AG, ob die ccfDNA nach automatisierter Extraktion den etablierten Qualitätsstandards entspricht. Dafür setzte die Forschungsabteilung den proprietären QuantYfeX^® Assay ein, mit dem der fetale Anteil in extrahierten Eluaten aus dem Plasma von Schwangeren ermittelt werden kann. Die Ergebnisse bestätigten, dass die fetale Fraktion im ccfDNA-Eluat nach automatisierter Extraktion auf dem QIAsymphony (blaue Balken) gegenüber der manuellen Aufreinigung (rote Balken) erhöht ist.

Die hier vorgestellten Ergebnisse werden abgerundet durch die Resultate, die mit dem NGS-basierten PraenaTest^®erzielt wurden und eine hervorragende Übereinstimmung zwischen beiden Extraktionsprotokollen zeigten. Diese Ergebnisse wurden auf mehreren internationalen und europäischen Fachtagungen präsentiert*.

Ausblick
Erste Machbarkeitsstudien dokumentieren die Eignung und die Leistungsfähigkeit des QIAsymphony-Systems für die Extraktion von ccfDNA aus dem Plasma von gesunden Spendern und von Schwangeren. Gepaart mit der enormen Aussagefähigkeit neuer NGS-basierter Technologien wird dieser Workflow in der translationalen Forschung, der Companion Diagnostics und der nicht-invasiven Pränataldiagnostik Einzug halten. QIAGEN begleitet diese Entwicklung und stellt Lösungen zur Verfügung, die den regulatorischen Anforderungen entsprechen.

^{*M. Frietsch[1], S. Groemminger [2], W. Hofmann[2], M. Sachse[2], A. Wolf[1], K. Beller[1]: Purification of Circulating Cell-Free DNA from plasma using the automated Large-Volume Extraction on the QIAsymphony SP Instrument. Posterpräsentation beim AMP Meeting 2014 in Washington, USA.
[1] QIAGEN GmbH, Research & Development, 40724 Hilden, Germany
[2] LifeCodexx AG, 78467 Konstanz, Germany}