Anwendungsbereich

Die DIN/EN/ISO 15189-2014 definiert umfangreiche Anforderungen an medizinische Laboratorien [1]. Neben allgemeinen und organisatorischen Aspekten muss die Umsetzung im Alltag dem aktuellen Stand der Wissenschaft entsprechen. Die Deutsche Akkreditierungsstelle (DAkkS) stellt allgemeine Checklisten zur Verfügung. Besonderheiten in den verschiedenen medizinischen Labordisziplinen können dort aber nicht ausreichend abgebildet werden. Aus diesem Grund stellen die Fachgesellschaften Dokumente bereit, die zusätzliche hilfreiche Informationen enthalten.
Diese Checkliste ersetzt die bisherige Version von 2012. Durch die mittlerweile erfolgte Überarbeitung der DIN/EN/ISO 15189-2014 und durch die Weiterentwicklung der immunologischen Labordia­gnostik wurden zahlreiche Forderungen entbehrlich, da sie bereits in der Norm exakt beschrieben werden oder in anderen Dokumenten der DAkkS (Beschlüsse, weitere Checklisten) zu finden sind. Die hier vorgestellte Checkliste hilft dem Labor bei der Erfüllung der Forderungen der Norm in allen Bereichen der immunologischen Diagnostik im medizinischen Labor, einschließlich:

1. Immunphänotypisierung (Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie, Immunzyto-/-histochemie)
2. Zellfunktionstests (ELISPOT, Zellstimulationstests, Durchflusszytometrie)
3. Immunglobulindiagnostik: Klassen und Subklassen
4. Autoantikörperbestimmung (Serologie, Durchflusszytometrie)
5. Allergologische Labordiagnostik (Serologie, Basophilenaktivierungstests)
6. Komplementdiagnostik/-analytik
7. Bestimmung weiterer immunologischer Mediatoren wie Zytokine, Chemokine, Signaltransduktion (Serologie, Durchflusszytometrie)

Weitere Hinweise finden sich in der allgemeinen Checkliste der DAkkS und in den Checklisten der verwandten Fachgebiete (Immungenetik, Hämatologie, Humangenetik). Wir haben hier nur die Informationen aufgeführt, die spezifisch für die Immundiagnostik sind und konzentrieren uns zudem auf die technischen Anforderungen (Teil 5 der DIN/EN/ISO 15189-2014).

Für zahlreiche Spezialuntersuchungen in der Immunologie sind keine CE-markierten IVD verfügbar. Hier müssen Testverfahren modifiziert oder selbst entwickelt werden (In-Haus-Tests, LDT). Dabei sind die Forderungen der IVD-R [2] einzuhalten. Durch die Vielzahl gleichartig durchzuführender Untersuchungen mit Austausch von Einzelkomponenten ist für viele Labore eine flexible Akkreditierung der Kategorie II erforderlich.

5.1 Personal

• Verfügt die verantwortliche Person über eine anerkannte Weiterbildung zum Facharzt oder Fachwissenschaftler mit Schwerpunkt Immundiagnostik, z. B. Facharzt für Laboratoriumsmedizin, Fachimmunologe DGfI oder Facharzt mit Zusatzbezeichnung Immunologie?
• Verfügen Mitarbeiter im Labor über eine den gesetzlichen Vorschriften entsprechende Ausbildung und Erfahrung (entsprechend einer MTLA) und über eine mindestens einjährige praktische Erfahrung unter einem qualifizierten Laborleiter?
• Besitzen die Mitarbeiter im Labor Zusatzqualifikationen, z. B. Fach-MTLA?
• Führen die Mitarbeiter in der Immundiagnostik diese Testverfahren regelmäßig durch (Kompetenzbewertung und Autorisierung durch Leitung)?
• Finden mindestens jährlich spezifische interne sowie möglichst zweijährlich externe Weiterbildungen bzw. Weiterbildungen durch externe Referenten statt (Planung und Nachweis, auch Webinare)?
• Wird sichergestellt, dass das Personal über eine für die Tätigkeit in der Immunologie ausreichende Farbunterscheidungsfähigkeit verfügt? Ist die Sprachfertigkeit den Aufgaben angemessen?

5.2 Räumlichkeiten undUmgebungsbedingungen

• Liegen für die Räumlichkeiten die gesetzlich vorgeschriebenen Genehmigungen vor (Infektionsschutz, Strahlenschutz, Gendiagnostik, Richtlinien, Brandschutz etc.)?
• Sind die Räumlichkeiten zugangsbeschränkt und entsprechend gekennzeichnet?
• Steht für die Immunfluoreszenz ein geeigneter Raum zur Verfügung?

5.3 Laboratoriumsausrüstung, Reagenzien und Verbrauchsgüter

• Werden Durchflusszytometer mit CE-IVD-Zulassung verwendet? Wenn nicht, liegen alle erforderlichen Nachweise zur Nutzung in der Diagnostik vor?
• Wird die korrekte Funktion und Geräte­einstellung des Durchflusszytometers hinsichtlich Fluidik, Detektoren, Laserfunktion mittels geeigneter Verfahren täglich überprüft und dokumentiert?
• Werden bei den Durchflusszytometern an jedem Benutzungstag als Teil des Kalibrierungsvorgangs für alle Fluorochrome Durchläufe mit entsprechenden optischen Standards (z. B. Partikeln) durchgeführt, und werden die Ergebnisse zu Qualitätskontrollzwecken protokolliert?
• Ist die durchflusszytometrische Software CE-IVD oder entsprechend qualifiziert?
• Wird die Sicherheitswerkbank jährlich überprüft, um sicherzustellen, dass die Filter ordnungsgemäß funktionieren, und die Luftströmungswerte innerhalb der Spezifikation liegen?
• Werden Temperaturen in Kühlgeräten, Kühlzellen, Inkubatoren, Bruträumen, Wasserbädern, Heiztischen, Trockenschränken usw. vorgegeben und werden diese durch kalibrierte Thermometer überprüft und dokumentiert?
• Wird in begasten CO2-Brutschränken jährlich die korrekte CO2-Messung überprüft?
• Existiert ein lichtstarkes Fluoreszenzmikroskop, ggf. mit Mitbeobachtereinrichtung oder Kamera?
• Wird bei Fluoreszenzmikroskopen über den Betrieb Nachweis geführt und werden Leuchtmittel fristgemäß gewechselt und regelmäßig justiert? Wird die Intensität durch geeignete Positivkontrollen regelmäßig überprüft?
• Wird bei ELISA-Readern und -Washern und anderen Geräten mit parallelen Komponenten die korrekte Funktion aller Kanäle überwacht?
• Sind die Messprotokolle bei ELISA-Readern überprüft?
• Werden bei seriell arbeitenden Geräten die vorgeschriebenen Wartungsintervalle (intern und extern) eingehalten?
• Entspricht die Kalibrierung der Pipetten den Vorgaben der DAkkS und wird die Rückführungspolitik beschrieben?
• Sind verwendete Verbrauchsmittel (Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Röhrchen, Umkehrosmose und andere) geeignet und überprüft?
• Werden Geräte vor Wartung/Reparatur nachweislich mikrobiologisch und/oder radioaktiv dekontaminiert?
• Sind die Laboraufzeichnungen in Bezug auf individuelle Untersuchungsreihen und Testbedingungen spezifisch, z. B. bzgl. Menge, Konzentration, Spezifität, Markierung und Qualität der eingesetzten Antikörperklone?
• Sind die Chargennummern der verwendeten kritischen Reagenzien (z. B. Antikörper, Konjugate, Stimulatoren etc.) in den Untersuchungsprotokollen dokumentiert?
• Werden die Herstellerempfehlungen zur korrekten Verwendung der Reagenzien befolgt oder wurde bei Modifikationen entsprechend validiert und bewertet?
• Wird definiert, unter welchen Bedingungen Patientenproben als interne Qualitätskontrollen eingesetzt werden dürfen?

5.4 Präanalytische Maßnahmen

• Werden präanalytische Besonderheiten im Primärprobenhandbuch beschrieben und ist dieses dem Einsender in der aktuellen Version zugänglich?
• Wurde festgelegt und begründet, innerhalb welcher Zeit nach Entnahme Proben im Labor bearbeitet werden müssen?
• Sind Akzeptanzkriterien zur Zurückweisung von Patientenproben festgelegt und dokumentiert? Werden die zurückgewiesenen Proben aufbewahrt?
• Gibt es eine Regelung über die Information und ggf. Schulung des Einsenders bei präanalytischen Problemen?
• Gibt es Regelungen für einen möglichst schnellen oder temperaturkritischen Probentransport ins Labor (Kryoglobuline, Komplementanalysen etc.)?
• Gibt es Lagerungshinweise für Proben, wenn die Bearbeitung erst später erfolgen kann (z. B. Probenlagerung, Einfrieren von Körperflüssigkeiten (Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit etc.), und für Zellen?
• Ist festgelegt, wie mit limitiert verfügbarem Probenmaterial (z. B. von Neugeborenen) verfahren wird?
• Gibt es Regelungen zur Festlegung des Schweregrades von Probenqualitätsveränderung (z. B. Hämolyse oder Lipämie) und wird dies an die bearbeitenden Abteilungen und den befundenden Arzt mitgeteilt?
• 5.5 Untersuchungsverfahren
• Sind für alle durchgeführten Untersuchungen Indikationen und diagnostische Wertigkeit belegt?    
• Wird die Indikationsstellung vom verantwortlichen Mitarbeiter ggf. überprüft und wenn notwendig mit dem Einsender abgestimmt?    
• Liegen zu allen Verfahren Verifizierungs- oder Validierungsprotokolle vor?
• Immunphänotypisierung [3, 4]
• Erfolgt die Bestimmung der absoluten Zellzahlen mit Ein- oder Zwei-Plattform-Strategie?
• Wird bei der Analyse der Gehalt an lebensfähigen Zellen mit geeigneten Mitteln ermittelt?
• Werden die Proben so behandelt, dass das „Capping“ (Migration), „Shedding“ (Ablösen des Antikörper-Membranantigen-Komplexes von der Zelloberfläche) und „Fading“ (Ausbleichen der Fluoreszenz) so minimal wie möglich sind?
• Wird die Gesamtzellzahl vor dem Ansatz überprüft und die Probe ggf. verdünnt?
• Wird bei jeder verwendeten Testmethode am Durchflusszytometer eine für die zu erwartende Häufigkeit von Einzelpopulationen ausreichende Anzahl an Zellen aufgenommen und analysiert?
• Werden die Messungen mit den korrekten Geräteeinstellungen gemessen?
• Sind die eingesetzten Antikörper der klinischen Fragestellung angemessen?
• Werden die Antikörper in einer angemessenen Konzentration eingesetzt? Wurde diese validiert?
• Werden bei selbst kombinierten Antikörpern die Mischverhältnisse auf eine mögliche Interferenz getestet?
• Werden bei angepassten oder laborentwickelten Assays neue Antikörperchargen gegen die alten Chargen getestet, z. B. mittels serieller Verdünnungen?
• Werden bei Notwendigkeit korrekte Isotypkontrollen bzw. Isoklonkontrollen eingesetzt?
• Wird eine unspezifische Bindung von Antikörpern ausgeschlossen?
• Wenn eine unspezifische Bindung nicht vermeidbar ist: Werden geeignete Maßnahmen ergriffen, z. B. das Blockieren der Fc-Rezeptoren durch Vorinkubation mit einem geeigneten Serum?
• Werden Antikörper vorgemischt? Wurde die Haltbarkeit validiert [5]?
• Wird bei jeder Untersuchung eine geeignete interne Kontrolle durchgeführt, zum Beispiel durch Kontrollproben oder Plausibilitätstests?
• Wird bei intrazellulären Färbungen die Permeabilisierung überprüft?
• Ist geklärt, wie mit nicht oder schwer lysierbaren Proben verfahren wird?
• Auf welche Weise und wie oft wird die korrekte Kompensation überprüft?
• Gibt es schriftliche Anweisungen zur Überprüfung automatisch gesetzter Gates und zum manuellen Gating? Wie wird sichergestellt, dass die Ergebnisse vom Operator unabhängig sind? Finden ggf. regelmäßige Konsensustrainingseinheiten statt und werden diese bewertet?
• Wird sichergestellt, dass keine abnormalen Zellen durch Gating von der Analyse ausgeschlossen werden?
• Hat das Labor für alle Messgrößen eine Strategie zur externen Qualitätssicherung (Ringversuch, Laborvergleich, andere)?

Zellfunktionstests

• Führt das Labor immunologische Zellfunktionstests durch
• -    mit durchflusszytometrischer Auswertung auf zellulärer Basis?
• -    mit zellulärer Auswertung auf ELISpot-Basis?
• -    mit Proliferationsnachweis nach Stimulation?
• -    mit Nachweis sezernierter Produkte nach Stimulation?
• Werden ausschließlich Antigene oder Allergene mit nachgewiesener Eignung und Stabilität eingesetzt?
• Werden auch andere Antigene eingesetzt als die vom Hersteller empfohlenen? Wenn ja, werden diese Allergene auf ihren Reinheitsgrad, potenzielle Kontamination mit LPS etc. hin untersucht?
• Werden Positiv- und Negativkontrollen im gleichen Ansatz (z. B. auf derselben Zellkulturplatte) mitgeführt?
• Werden die Effekte von Antigen- und Mitogenstimulation zu validierten Zeitpunkten analysiert?
• Gibt es für alle zellulären Tests festgelegte Kriterien für akzeptable Hintergrundaktivitäten?
• Allergiediagnostik
• Werden ausschließlich Allergene mit nachgewiesener Eignung und Stabilität eingesetzt?
• Beim Einsatz von Serumpools als interne Kontrollen: Wurden diese validiert (siehe auch 5.3)?
• Sind für alle Allergene Positivkontrollen vorhanden und in welchen Abständen werden diese – wenn abwechselnd verschiedene Kontrollen eingesetzt werden – getestet?
• Autoantikörperdiagnostik
• Wird im Labor die Autoantikörper­diagnostik durchgeführt
  • mittels indirekter Immunfluoreszenz?
  • mithilfe von ELISAs?
  • mithilfe von Immunoblots?
  • mithilfe von Bead-gekoppelten Assays?
  • mit automatisierten Immunoassays (z. B. Chemilumineszenztests)?    
• Entsprechen das Vorgehen und die angebotenen Parameter den Empfehlungen der Fachgesellschaften?
• Weisen die verwendeten Substrate (HEp-2-Zellen, Gewebeschnitte) eine hohe Qualität der Antigene und ausreichend Mitosen auf?
• Werden Untersuchungen mittels indirekter Immunfluoreszenz immer nachweislich durch zwei qualifizierte Mitarbeiter abgelesen (Vier-Augen-Prinzip) und wird dies entsprechend dokumentiert?
• Werden regelmäßig (z. B. halbjährlich) Vergleichsablesungen am Fluoreszenzmikroskop zwischen den Mitarbeitern durchgeführt und bewertet (Konsensustraining)?
• Wird speziell im Cut-Off-Bereich bei der Bewertung „positiv“ vs. „negativ“ eine schwach positive Kontrolle eingesetzt und bewertet?
• Erfolgt ein regelmäßiger Wechsel der Positivkontrolle bei der indirekten Immunfluoreszenz mit HEp-2-Zellen bezüglich verschiedener Muster?

Immunoassays

• Wurden die eingesetzten Immunoassays (z. B. ECLIA etc.) ausreichend verifiziert und mit dem vorhergehenden Assay mittels einer ausreichenden Anzahl von Patientenproben verglichen?
• Wenn ein Bias zwischen den Verfahren vorliegt, wie kommt dieser zum Tragen (z. B. bei den verwendeten Referenzbereichen)?
• Ist festgelegt, wie mit Messwerten oberhalb des Messbereichs vorgegangen wird? Wenn Seren verdünnt eingesetzt werden, wurde die Linearität untersucht und dokumentiert?
• Ist sichergestellt, dass die Ergebnisse baugleicher Geräte vergleichbar sind?
• Komplementanalytik
• Werden für die hämolytischen Funktionstests geeignete Zellen (Erythrozyten) in ausreichender und konstanter Qualität eingesetzt?
• Wird das für verschiedene Parameter adäquate Probenmaterial (Serum, EDTA-Plasma) eingesetzt?
• Sind validierte Testmethoden vorhanden, die bei limitiertem Probenmaterial (z. B. von Neugeborenen) eingesetzt werden können?
• Ist festgelegt, wie mit Messwerten oberhalb des Messbereichs vorgegangen wird? Wenn Seren verdünnt eingesetzt werden, wurde die Linearität untersucht und dokumentiert?
• 5.6 Sicherung der Qualität der Untersuchungsverfahren
• Hat das Labor für alle Messgrößen adäquate Maßnahmen zur internen (laborinterne Präzisions- und Richtigkeitskontrolle) und externen Qualitätssicherung (Ringversuch, Laborvergleich und andere)?
• Wird bei zellulären Verfahren (Durchflusszytometrie, Zellfunktion) eine geeignete Prozesskontrolle (z. B. Blut eines gesunden Erwachsenen) an jedem Untersuchungstag mitgeführt?
• Werden bei Untersuchungen, bei denen keine geeigneten Prozesskontrollen verfügbar sind, geeignete Maßnahmen ergriffen? Sind die Unterschiede zwischen der verwendeten Kontrollmaßnahme und den tatsächlich durchgeführten Prozessen bekannt und dokumentiert?
• Werden geeignete Kontrollen zur Sicherstellung der Sensitivität und Spezifität mitgeführt?
• Wird bei durchflusszytometrischen und Zellstimulationsmessungen eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse sichergestellt, wenn die Messungen an mehreren Geräten erfolgen?
• Beteiligt sich das Labor für alle durchgeführten Verfahren an anerkannten Ringversuchen oder organisiert Laborvergleiche, wenn es keine anerkannten Ringversuche zu dem gemessenen Parameter gibt?
• Wurden die in den zellulären Stimulationstests eingesetzten Antikörper, Antigene und Mitogene in Bezug auf ihren Dosis-Wirkungseffekt hin untersucht und ist dies dokumentiert? Wie wird die Haltbarkeit einer Charge an Stimulantien/Allergenen überprüft? Werden Allergene/Stimulantien über die Haltbarkeitsgrenze hinaus verwendet und wie wird dies validiert?
• Wird bei serologischen Allergie- und Autoantikörpernachweisen durch ein geeignetes Verfahren sichergestellt, dass Spezifität und Sensitivität gewährleistet sind?
• Werden bei sequenziellem Bearbeiten von Tests RiLiBÄK-konform Kontrollen wiederholt?
• Werden beim Einsatz von Immunoassays Qualitätskontrollproben in mindestens zwei unterschiedlichen Konzentrationsbereichen eingesetzt?
• Wird ein Protokoll über ungewöhnliche, schwierige oder lehrreiche Fälle geführt?
• Gibt es eine Risikoanalyse für verschiedene Parameter mit den möglichen Auswirkungen auf klinische Entscheidungen?
• Gibt es ein etabliertes Fehlermanagement, wie z. B. CIRS (anonym), oder eine Fehlerkultur mit direkter Analyse und Aufarbeitung von Fehlern?
• Werden Reagenzienmängel oder Lieferschwierigkeiten protokolliert und an die geeigneten Stellen gemeldet?
• Werden alle baugleiche Geräte bei der externen Qualitätssicherung berücksichtigt? Werden die Ergebnisse dokumentiert und interpretiert? Werden ggf. Maßnahmen eingeleitet?

5.7 Postanalytische Maßnahmen

• Werden bearbeitete Proben so aufbewahrt, dass ggf. eine Nachanalyse möglich ist? Wir werden diese Bedingungen und der Zeitraum festgelegt?
• Werden Maßnahmen zur Datensicherheit elektronisch erhobener Messwert ergriffen?
• Werden regelmäßig Datenbackups durchgeführt und ist nachgewiesen, dass die Daten wieder eingelesen werden können?

5.8 Befundberichte

• Werden alle Plots, Ausdrucke und sonstigen Untersuchungsergebnisse ausreichend gekennzeichnet und personalisiert, und werden die Kennzeichnungen bei der Befundung überprüft?
• Wird sichergestellt, dass bei der Übertragung von Daten in Datenverarbeitungssysteme keine Fehler auftreten?
• Wie werden Daten vor Überschreiben, Löschen oder Manipulation geschützt?
• Erfolgte ggf. eine Schnittstellenvalidation?
• Wie wird die Veränderung von Befunden bei der Reanalyse durchflusszytometrischer Daten, z. B. mit Veränderung von Gates, dokumentiert?
• Wie werden Befundkorrekturen dokumentiert? Sind diese mit Datum der Korrektur versehen und signiert?    

5.9 Freigabe der Ergebnisse

• Werden die Ergebnisse aufwendiger Verfahren (durchflusszytometrische und Zellfunktionsanalysen, Komplementanalytik usw.) vom Laborleiter oder seinem Beauftragten anhand der Originaldaten (Plots, ELISA-Ausdruck, Protokolle) überprüft und befundet?
• Wendet das Labor alterskorrigierte und geschlechtsspezifische Referenzintervalle an und ist deren Herkunft dokumentiert sowie die Anwendbarkeit im Labor regelmäßig überprüft (6)?
• Ist im papierlosen Labor die korrekte Zuordnung der digitalen Daten gewährleistet?
• Werden Autoantikörperbefunde aus Immunfluoreszenz und immunologischen Bindungsassays miteinander abgeglichen?
• Werden Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen der Laboruntersuchungen im Bereich der Immunologie und anderen Befunden auf ihre klinische Relevanz untersucht, mit dem Kliniker diskutiert und dokumentiert?
• Werden unplausible Ergebnisse mit anderen Methoden oder an anderen Geräten im Labor oder in anderen Laboren gegengetestet?
• Werden die Ergebnisse von Tests, die das Personal in Abwesenheit des Leiters durchgeführt hat, im Laufe der nächsten routinemäßigen Arbeitsschicht vom Laborleiter oder seinem Beauftragten überprüft?
• Enthält der Abschlussbericht eine geeignete Zusammenfassung der verwendeten Methoden, Referenzintervalle und eine Interpretationshilfe für den behandelnden Arzt?
• Wird im Abschlussbericht auf aufgetretene mögliche Störfaktoren eingegangen?

5.10 Informationsmanagement des Laboratoriums

• Werden die Daten von immunologischen Messgeräten regelmäßig gesichert?
• Wird die korrekte Übertragung von Patientendaten und Ergebnissen zwischen Geräten und EDV-Systemen validiert und überprüft?
• Ist die personalisierte Nutzung von computergestützten Systemen gewährleistet?    
• Werden elektronische Befunde oder definierte Datenfiles so aufbewahrt, dass sichergestellt ist, dass es nicht zu einem Datenverlust durch Hardwaredefekte oder sonstige Umwelteinflüsse kommen kann?