Was man unbedingt beachten sollte, wenn man Experimente macht

Einfluss des Darmmikrobioms auf das Immunsystem

Der Gastrointestinaltrakt beheimatet den Großteil des humanen Mikrobioms, das überwiegend aus Bakterien, aber auch aus Pilzen, Archaeen und eukaryotischen Ein- und Mehrzellern sowie deren Viren besteht. Eine dynamische Balance zwischen den Mitgliedern dieser vielfältigen Gemeinschaften mit dem mukosalen Immunsystem trägt wesentlich zur Darmhomöostase bei [1]. Dies spiegelt sich in der seit Langem bekannten großen Anzahl aktivierter Immunzellen im Darm wider und erklärt den bereits vor Jahrzehnten identifizierten starken Einfluss des Darmmikrobioms auf die Reifung und Ausprägung des mukosalen Immunsystems [2].
John Cebra war einer der ersten Wissenschaftler, der die Bedeutung des Mikro­bioms auf das mukosale Immunsystem systematisch untersuchte. Er beschrieb signifikante Unterschiede im Darmimmunsystem zwischen konventio­nell gehaltenen und keimfrei gezüchteten Mäusen [3]. Darüber hinaus identifizierte er eine besonders stark auf das Immunsystem der Maus wirkende Bakterienspezies, die sogenannten segmented filamentous bacteria (SFB) (Abb. 1) [4]. Eine Monokolonisierung von keimfreien Mäusen mit SFB-Bakterien führte zur verstärkten Rekrutierung und Aktivierung von intestinalen T- und B-Lymphozyten. Der Befund von John Cebra wurde schließlich durch die Arbeitsgruppe von Nadine Cerf-Bensussan und Dan Littman bestätigt und vertieft [5, 6]. Dan Littman konnte zudem zeigen, dass die durch die SFB-Besiedlung induzierten Th17-T-Lymphozyten SFB-Antigene erkennen, was bedeutet, dass die Mikro­biota-abhängige Induktion von Th17-Lymphozyten Erregerantigen-spezifisch geschieht [7]. Nach wie vor ist nicht klar, warum SFBs diesen besonderen immunstimulatorischen Reiz verursachen. Vergleichende Arbeiten mit verschiedenen kommensalen und pathogenen Bakterien legen aber nahe, dass die bei SFBs besonders stark ausgeprägte Adhäsion an die Epithelzellen des Dünndarms eine wichtige Rolle spielt [8]. Im Menschen wurden SFBs bisher nicht beschrieben.
Bacteroides fragilis stellt ein wichtiges Mitglied des Darmmikrobioms von gesunden Individuen dar. Sarkis Mazmanian identifizierte in einer Reihe von Arbeiten das von B. fragilis synthetisierte und in sogenannten outer membrane vesicles (OMV) freigesetzte zwitterionische Kapselpolysaccharid PSA als starken Induktor einer Toll-like Rezeptor (TLR)-2-abhängigen Interleukin (IL)-10-Sekretion und Stimulation regulatorischer T-Lymphozyten (Abb. 1) [9]. Einen anderen Mechanismus der Induktion regulatorischer T-Lymphozyten stellt die Produktion großer Mengen an kurzkettigen Fettsäuren durch anaerobe Bakterien dar [10]. In präklinischen Studien konnte die orale Gabe einer Mischung verschiedener Clostridienspezies, die kurzkettige Fettsäuren produzieren, regulatorische
T-Lymphozyten induzieren und somit vor einer immunologisch-vermittelten Gewebeschädigung schützen [11]. Neben Bacteroides fragilis und verschiedenen Clostridienspezies ist auch Bifidobacterium infantis bei Mäusen in der Lage, anti-inflammatorische regulatorische T-Lymphozyten zu induzieren [12]. Beim Menschen wird Faecalibacterium prausnitzii eine wichtige Rolle bei der Induktion regulatorischer T-Lymphozyten zugesprochen. Interessanterweise ist die Zahl dieser F. prausnitzii-spezifischen T-Lymphozyten bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vermindert [13].
Neben der Anwesenheit besonders immunstimulatorischer Bakterienspezies scheint auch die Diversität des Mikrobioms selbst und der Zeitpunkt der Besiedlung eine Rolle zu spielen. Kathy McCoy fand in keimfrei gezüchteten Mäusen eine stark erhöhte Immunglobulin-E-Produktion [14]. Diese IgE-Produktion, die möglicherweise die Entstehung von durch Typ2-Immunantworten verursachte Krankheiten wie Asthma fördern könnte, konnte nur durch die Gabe mehrerer Bakterien während der frühen Entwicklungszeit der Tiere normalisiert werden.
Erst zu einem späteren Zeitpunkt wurde auch der Einfluss des Darmmi­krobioms auf das systemische Immunsystem demonstriert. Jeff Weiser zeigte 2010, dass bakterielle Peptidoglykan-Fragmente die mukosale Darmbarriere überschreiten, und durch Aktivierung des nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein (Nod)1, eines Rezeptors des angeborenen Immunsystems, die Reifung von Granulozyten im Knochenmark stimulieren (Abb. 1) [15]. Diese Erkenntnisse wurden im Anschluss von Oh und Kollegen bestätigt. Sie konnten zeigen, dass das von Bakterien des Darm­mikrobioms stammende Flagellin via TLR5 die systemische humorale Immun­antwort auf nicht-adjuvantierte Influenza- und Poliototimpfstoffe verstärkt [16]. Des Weiteren beobachtete die Gruppe von Worthen bei Neugeborenen von Antibiotika-behandelten Muttertieren – ähnlich wie in keimfreien, neugeborenen Mäusen – eine verminderte Expression von IL-17 durch Typ 3 innate lymphoid cells (ILCs), eine reduzierte Produktion von GM-CSF und neutrophile Granulozyten sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bakteriellen systemischen Infektionen mit E. coli und Klebsiella [17]. Auch hierbei scheint das Alter eine wichtige Rolle zu spielen. Ramnik Xavier fand bei Kindern aus Finnland, Estland bzw. Russland im Darmmikrobiom Unterschiede in der Anzahl kommensaler Bakterien mit niedrig-stimulatorischem LPS (Bacteroides) und hoch-stimulatorischem LPS (E. coli), und konnte diese mit der Allergieprävalenz assoziieren. Darüber hinaus konnte er die Bedeutung von hoch-stimulatorischem LPS beim Schutz vor Auto­immunerkrankungen tierexperimentell bestätigen [18].
Diese Ergebnisse illustrieren die Bedeutung des Darmmikrobioms für die Reifung und Aktivierung des mukosalen und systemischen Immunsystems. Auch wenn das Mikrobiom in seiner Vielfalt mit dem Wirt interagiert, scheinen einige Bakterienarten durch ihre Adhäsion an das Darmepithel sowie die Produktion immunstimulatorischer Moleküle und Metabolite einen besonders starken und ggf. sogar spezifischen Einfluss auszuüben.

[30]. Da bisher in vielen Fällen nicht bekannt ist, ob und ggf. wie diese Unterschiede verschiedene Tiermodelle beeinflussen, gibt es dringenden Bedarf für ein erhöhtes Bewusstsein in der immunologischen Forschungsgemeinschaft für die sich möglicherweise hieraus ergebende Problematik.
In vielen relevanten Tiermodellen für menschliche Erkrankungen konnte bereits experimentell gezeigt werden, dass Änderungen in der Mikrobiotazusammensetzung den Verlauf oder sogar den Pathomechanismus beeinflussen. Die ersten entsprechenden Beobachtungen wurden in verschiedenen Gen-defizienten Mauslinien wie Il10-/-- oder Tcra-/--Mäusen gemacht, bei denen bereits vor über 30 Jahren festgestellt wurde, dass die Entstehung von Symptomen der akuten Darmentzündung stark davon abhing, in welcher Forschungseinrichtung und in welchem Tierstall die Tiere gehalten wurden [31]. In den letzten Jahren konnte z. B. gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Helicobacter hepaticus, Norovirus oder Mukus-degradierenden Bakterien wie Akkermansia muciniphila in IL-10-defizienten Tieren die Schwere der Darmentzündung modulieren. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in anderen Mausmodellen für chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie dem chemisch-induzierten DSS-Modell oder dem CD45RBhigh-T-Zell-Transfer-Modell gemacht [32, 33]. Im akuten DSS-Modell konnte gezeigt werden, dass die Variation in der Mikrobiotazusammensetzung zwischen verschiedenen Züchtern einen signifikanten Einfluss auf die Schwere der Krankheit in genetisch-identischen Mäusen hat [32]. Zusätzlich bestimmt in diesem Modell die Mikrobiotazusammensetzung auch wesentlich, welcher Immuneffektormechanismus in der Krankheitsentstehung involviert ist. In einem Fall konnte beobachtet werden, dass die Gewebeschädigung durch CD4+-T-Lymphozyten verursacht wird, während sie unter anderen Mikrobiotabedingungen unabhängig von B- und T-Lymphozyten verursacht wird. Außer in Modellen für chronisch entzündliche Darmerkrankungen wurde ein Einfluss der Mikrobiotazusammensetzung auch in Modellen für Diät-induziertes Übergewicht [34], Malaria [35] und Schlaganfall [36] beobachtet.
Durch diesen weitreichenden Einfluss des Mikrobioms auf praktisch allen Ebenen der Physiologie von Versuchstieren ist ein Bewusstsein über Variabilität im Mikrobiom nicht nur für Mikrobiom-bezogene Experimente, sondern für praktisch alle immunologischen Studien von Relevanz. Verschiedene Gruppen von Wissenschaftlern haben deshalb Konzepte entwickelt, um ungewollte Einflüsse durch Variabilität im Mikrobiom auszuschließen [37–40]. Im Mittelpunkt stehen einerseits Ansätze zur Normalisierung des Mikrobioms, d. h. die Erzeugung von isobiotischen Mauslinien (Mauslinien mit gleichem Mikrobiom), durch die Verwendung von Wildtyp (WT) und Gen-defizienten Geschwistertieren oder das „Co-housing“ bei getrennt gezüchteten WT und Gen-defizienten Tieren. Während das „Co-housing“ in einer Vielzahl von Fällen erfolgreich eingesetzt wurde, um Mikrobiom-modulierte Phänotypen aufzuklären, ist dieser Ansatz trotz allem limitiert (Abb. 2). So ignoriert er langfristige Effekte des Mikrobioms, die bereits in utero oder in der neonatalen Phase auf das sich entwickelnde Immunsystem wirken [21, 41]. Das ebenfalls verwendete sogenannte „Cross-fostering“, bei dem neugeborene Tiere zwischen Müttern ausgetauscht werden, kann diesen Effekt nur zum Teil aufheben. Ein weit verbreiteter Ansatz, auch wenn meist nicht aus Gründen der Mikrobiota-Normalisierung, sondern aus genetischen Gründen, ist das „Cross-breeding“, bei dem WT und Gen-defiziente Geschwistertiere („littermates“) mittels heterozygoter Elterntiere gezüchtet werden.
Um hingegen den Einfluss eines veränderten Mikrobioms auf einen physiologischen Prozess zu studieren, stehen andere Modelle zur Verfügung. Einerseits können komplexe Gemeinschaften durch Stuhltransplantation in keimfreie oder durch Antibiotikagabe konditionierte Mäuse übertragen werden. Andererseits können nach zielgerichteter Isolierung von Kandidatenbakterien diese Spezies in Mäuse mit definiertem oder niedrig diversem Mikrobiom transferiert werden. Im Fall von genetisch identischen Mäusen mit sich unterscheidendem Mikrobiom spricht man von sogenannten isogenen Mauslinien [38].
Neben stochastisch oder Haltungs-bedingten Veränderungen im Mikro­biom, die bereits vor Beginn des Experiments auftreten, können diese auch im Verlaufe eines Experiments eintreten, z. B. durch die veränderte Schwere einer Erkrankung. Für einige Beispiele konnte bereits gezeigt werden, dass diese Veränderungen die Phänotypen aktiv beeinflussen [42]. 
Aus der geschilderten Vielzahl von Beobachtungen zum Einfluss des Mikrobioms auf das Immunsystem sowie der Variabilität im Mikrobiom zwischen Versuchstieren ergeben sich schlussfolgernd große Herausforderungen für experimentelle Wissenschaftler. Die Beachtung von grundlegenden Prinzipien zur Normalisierung von Mikrobiotazusammensetzung sowie die dynamische Beobachtung seiner Zusammensetzung hat jedoch das Potenzial, die Anzahl der Studien zu reduzieren, deren Auslegung durch den unbeabsichtigten Einfluss der Mikrobiota beeinflusst wurde. Die Umsetzung dieser Prinzipien könnte somit langfristig zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit von Studien führen.

Einfluss des Immunsystems auf das Mikrobiom

Auf der anderen Seite beeinflussen neben Alter, Nahrung, Haltungsbedingungen und genetischen Faktoren auch Effektormoleküle des angeborenen und adaptiven Immunsystems die bakterielle Zusammensetzung und anatomische Verteilung des Mikrobioms. Nita Salzman konnte 2010 zeigen, dass sowohl das Fehlen als auch die Expression eines zusätzlichen konstitutiv exprimierten enterischen antimikrobiellen Peptides das Darmmikrobiom signifikant verändert [19]. Daneben wird die Verteilung der Bakterien und insbesondere ihre Nähe zur epithelialen Oberfläche durch die Expression des c-Typ-Lectins Reg3γ beeinflusst [20]. Auch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems beeinflussen das Darmmikrobiom. So prägt die epitheliale Expression des Flagellin-Rezeptors TLR5 beim murinen Neugeborenen die bakterielle Zusammensetzung des sich entwickelnden Mikrobioms [21]. Ähnlich führt das Fehlen des Nlrp6-Inflammasoms zu einer stärker proinflammatorisch wirkenden bakteriellen Zusammensetzung im Dickdarm [22]. Dabei spielt die stimulatorische Ausgangslage, d. h. die Anwesenheit von sogenannten Pathobionten im Mikrobiom, eine entscheidende Rolle [23], da andere Gruppen unter anderen Haltungsbedingungen (s. u.) keine Änderungen im Mikrobiom von Nlrp6-defizienten Tieren beobachteten [24, 25]. Wie erwartet trägt auch das adaptive Immunsystem und insbesondere Immunglobulin (Ig) A zur bakteriellen Zusammensetzung bei. Interessanterweise geschieht die Rag-vermittelte Editierung des V(D)J-Lokus neben dem Knochenmark auch in der Lamina propria der Darmmukosa und wird durch Stimuli des Mikrobioms beeinflusst [26]. Das dann sekretierte IgA ist polyreaktiv und zeigt nur einen geringen Grad der somatischen Hypermutation, ohne signifikante Bedeutung für die Affinität an kommensale Bakterien [27]. Interessanterweise scheint IgA dabei auch zur Kolonisierung durch bestimmte Bakterienarten beizutragen [28]. Damit ergibt sich ein Bild, in dem das mukosale Immunsystem und das Darmmikrobiom zwei sich gegenseitig beeinflussende und in der Balance haltende Faktoren darstellen. Dies erklärt, warum sowohl Änderungen der bakteriellen Zusammensetzung des Mikrobioms als auch Störungen des Immunsystems zu einer Schädigung des Darmgewebes führen können.

Variabilität im Darmmikrobiom von Versuchstieren und die Auswirkung auf die Immunologie

Trotz großer Anstrengungen in den letzten Jahren alternative Modelle zu entwickeln, haben Versuchstiere weiterhin wichtige Anwendungen und Funktio­nen in der immunologischen Forschung (Abb. 2). Dies ergibt sich zum einen aus der intrinsischen Komplexität und Dynamik des Immunsystems sowie zum anderen aus der Vielzahl von Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedensten Organsystemen. Ein an Bedeutung gewinnender Aspekt ist der Einfluss des Mikrobioms auf die Entwicklung und Funktion von Immunzellen unter physiologischen Bedingungen sowie während vieler pathophysiologischer Prozesse. Um den komplexen, modulatorischen Einfluss des Mikro­bioms auf seinen Wirt auf molekularer Ebene weiter zu ergründen und die Entwicklung von Mikrobiom-basierten Behandlungsansätzen voranzutreiben, sind neuartige Tiermodelle und Versuchsansätze notwendig.
Während gnotobiotische Modelle (keimfreie und gezielt kolonisierte Tiere) es erlauben, Experimente unter präzise kontrollierbaren Mikrobiota-Versuchsbedingungen durchzuführen, ist die Haltung dieser Tiere sehr aufwendig und an vielen Forschungseinrichtungen derzeit nicht möglich. Die Tierhaltung unter specific pathogen free (SPF)-Bedingungen wurde in der Versuchstierkunde ursprünglich eingeführt, um die Variabilität der Versuchsbedingungen durch Ausschluss von relevanten Pathogenen aus der Tierhaltung zu minimieren. Diese Form der Haltung ist an vielen Standorten inzwischen Standard. Bei sogenannten specific and opportunistic pathogen free (SOPF)-Tieren sind weitere Mikroorganismen ausgeschlossen, die in immundefizienten Tieren mitunter Haltungsprobleme verursachen. Es muss jedoch bemerkt werden, dass die Ausdrücke SOPF/SPF keinen einheitlichen Hygienezustand bezeichnen, sondern trotz des Vorliegens von europäischen Leitlinien individuell definiert werden. Für Experimente unter sogenannten konventionellen Haltungsbedingungen gelten niedrigere Hygieneanforderungen, was häufig dazu führt, dass diese Tiere mit stark immunomodulatorischen Bakterien wie Helicobacter spp., murinen Noroviren oder auch Protisten wie Tritrichomonas spp. besiedelt sind. Auch diese Haltungsform kommt in Deutschland noch häufig vor.
Eine große Vergleichsstudie der Mikro­biotazusammensetzung in insgesamt 13 deutschen Versuchstierhaltungen durch Mitglieder des DFG-geförderten SPP1656 „Intestinales Mikrobiom“ identifizierte große Unterschiede im Darmmikrobiom zwischen den Standorten, jedoch auch innerhalb eines Standorts in den verschiedenen Haltungsbarrieren [29]. Es wurden sowohl Unterschiede in der Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaften sowie die Anwesenheit bzw. das Fehlen von Bakterien bzw. Bakteriengruppen (mit möglicherweise immun­modulatorischen Eigenschaften) gefunden. Unterschiede traten auch in genetisch identischen Mäusen auf, die von verschiedenen Züchtern bezogen wurden