Lexikon der resistenzvermittelnden Mutationen

Gesamtgenomsequenzierung in der Mikrobiologie am Beispiel der Tuberkulose

Multiresistente Erreger der Tuberkulose stellen weltweit eine zunehmende Bedrohung dar. Dank neuer Verfahren zur Gesamtgenomsequenzierung kann man heute genetische Resistenzprofile erstellen, auf deren Grundlage eine rasche und individualisierte Behandlung der Patienten möglich ist. Gleichzeitig ermöglichen die genomischen Informationen auch eine epidemiologische Überwachung mit größtmöglicher Auflösung.
Schlüsselwörter: MDR-Tuberkulose, Gesamtgenomsequenzierung, Antibiose, Epidemiologie

Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) erkranken global jährlich 9,6 Mio. Menschen an Tuberkulose (TB). Mit ca. 1,5 Mio. Todesfällen im Jahr ist sie die tödlichste bakterielle Infektionskrankheit weltweit. Ein besonderes Problem stellt die zunehmende Verbreitung und Übertragung multiresistenter (MDR) TB-Erreger dar. Hier rechnet die WHO mit fast einer halben Million Neuerkrankungen pro Jahr, die nur in der Hälfte der Fälle erfolgreich behandelt werden können.

Definition und Behandlung

Eine MDR-TB ist durch die Resistenz gegenüber den beiden wirksamsten Medikamenten Isoniazid und Rifampicin gekennzeichnet. Das macht den Einsatz von Zweitrangtherapeutika notwendig, die aber teilweise schwerwiegende Nebenwirkungen haben und trotz einer Verdreifachung der durchschnittlichen Behandlungsdauer geringere Heilungsraten aufweisen.
Immer häufiger treten extrem resistente (XDR) Stämme auf, die zusätzlich Resistenzen gegenüber einem der Fluorchinole und einem intravenös verabreichten Medikament aufweisen. Hier können die Behandlungskosten auf über 100.000 Euro pro Fall ansteigen^[1].
Die Vertreter des Mycobacterium
tuberculosis Komplexes erwerben ihre
Resistenzen ausschließlich durch Mutationen im Erbgut; diese werden also an alle Nachkommen weitergegeben. Deshalb ist eine ineffektive Behandlung so gefährlich, denn so können einzelne Bakterien zufällige Resistenzmutationen ausbilden und durch die Antibiotikaselektion zum dominanten Stamm werden. Um zu verhindern, dass ein Patient solche Mutanten unter der Therapie entwickelt und weitergibt, wird normalerweise mit vier effektiven Antibiotika gleichzeitig behandelt.

Ablaufschema der mikrobiologischen (violett) und molekularen (blau) Diagnostik in einem Tuberkulosereferenzlabor.

Bedeutung der Resistenztestung

Als Goldstandard zum Erregernachweis und zur Ermittlung des Resistenzprofils gelten kulturbasierte Methoden, doch aufgrund der langen Generationszeit von über 24 h kann frühestens nach drei Wochen ein umfassendes Resistenzprofil erstellt werden. In dieser Zeit wird der Patient möglicherweise nicht effektiv behandelt und bleibt damit potenziell infektiös.
Allerdings wird die mikrobiologische Tuberkulosediagnostik bereits seit Jahren durch molekulare Tests ergänzt, die Mutationen in definierten Regionen des Erregererbguts nachweisen. Da diese Analytik eine schnelle und kostengünstige Infektions- und Resistenztestung ermöglicht, wird sie mit Empfehlung der WHO weltweit eingesetzt, insbesondere in Hochinzidenzgebieten wie zum Beispiel im südlichen Afrika.
Ein Nachteil der molekularen Tests im Vergleich zu Bakterienkulturen ist die geringere Sensitivität bei direkten Patientenisolaten (Sputum). Zudem können nur
diejenigen Mutationen nachgewiesen werden, die sich in den untersuchten Zielregionen befinden. Somit werden mit diesen Assays nicht alle TB-Antibiotika abgedeckt. Kürzlich zeigte eine Studie von MSF (Ärzte ohne Grenzen) und dem Forschungszentrum Borstel, dass in Swasiland (einer Region zwischen Südafrika und Mosambik mit einer der höchsten TB-Inzidenzen weltweit) etwa ein Drittel aller MDR-Stämme eine gegen Rifampicin resistenzvermittelnde Mutation aufwies, die von den derzeit gängigen molekularen Testsystemen nicht erkannt wird^[2].

Resistenzvorhersage

Die neuen Verfahren der Hochdurchsatzsequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) eröffnen nun die Möglichkeit, das komplette Erbgut eines Erregers in einem einzigen Arbeitsgang zu entschlüsseln. Daraus lassen sich umfassende Resistenzprofile und Übertragungswege des Erregers herleiten. Die Technik basiert auf der massiv parallelisierten Sequenzierung kurzer DNA-Fragmente von etwa 300 bis 1.000 Basenpaaren. Als Ergebnis erhält man Millionen von „Reads“, die mithilfe bioinformatischer Algorithmen – im Falle der TB durch Vergleich mit einem Referenzgenom – zu nahezu kompletten Sequenzen (ca. 99%) zusammengefügt werden können. Derzeit kennt man etwa 400 Mutationen in 60 Genabschnitten, die das Resistenzprofil des untersuchten Erregerstammes vorherzusagen erlauben.
Schon heute ist diese Technik schneller und kosteneffektiver als die TB-Routinediagnostik^[3]. Insbesondere ermöglicht sie auch die Charakterisierung noch unbekannter Mutationen durch Abgleich mit den Ergebnissen der kulturbasierten Resistenztestung. Wie gut dies in der Praxis funktioniert, zeigt eine Studie der Universität Oxford^[4], bei der Genom- und Resistenzdaten von 3.653 Stämmen systematisch verglichen wurden. Ohne auf bereits vorhandenes Wissen zurückzugreifen, konnten die Autoren zeigen, dass 80% der resistenten Stämme Mutationen in 23 resistenzassoziierten Genen aufwiesen, während 80% der sensiblen Stämme keine derartigen Mutationen besaßen.
Im Zusammenspiel mit der klassischen Resistenzbestimmung und einer präzisen phänotypischen Charakterisierung liefern genomische Daten entscheidende klinische Hinweise. So konnten wir gemeinsam mit dem TB-Referenzlabor in Gauting bei München in einer Fallstudie eine bisher unbekannte Doppelresistenz gegen die beiden neuen TB-Antibiotika Bedaquiline und Delamanid nachweisen^[5]. Auf diese Weise gewonnene Erkenntnisse liefern somit Schritt für Schritt ein stets aktuelles „genetisches Lexikon der Mutationen“ von TB-Erregern, welches zur Etablierung einer individualisierten Therapie herangezogen werden kann.

Phylogenetischer Baum eines Tuberkuloseausbruchs mit 26 Fällen in Hamburg. Die Farben geben bekannte epidemiologische Verknüpfungen zwischen den Fällen an, die Länge der Striche repräsentiert den „molekularen Abstand“ zwischen den Stämmen. (Zum Vergrößern bitte anklicken)

Epidemiologische Aspekte

Der Nachweis von Infektionsketten durch die Gesundheitsämter erfolgt in Deutschland über ein meldepflichtiges System mit anschließender Kontrolle von Kontaktpersonen. Dieses Verfahren wird zwar heute schon durch molekularbiologische Methoden wie etwa den genetischen Fingerabdruck unterstützt, doch künftig ist durch die Genomsequenzierung eine erheblich erhöhte Trennschärfe zu erwarten. Während die traditionelle Genotypisierung nur Gruppen potenziell nahe verwandter Stämme anhand identischer Muster erkennt, erlaubt NGS höchste Auflösung auf Ausbruchniveau bis hin zur Aufklärung einzelner Übertragungswege. Die Abbildung rechts oben zeigt ein Beispiel aus einer Studie in Hamburg^[6].
Die Genomsequenzierung erlaubt somit gezielte Interventionsmaßnahmen zur Eindämmung von Ausbrüchen und gibt auch Auskunft darüber, ob steigende MDR-TB-Fallzahlen auf ineffektive Behandlung oder Übertragung multiresistenter Stämme in einer Region zurückzuführen sind. Und schließlich lässt sich anhand der Daten auch die Evolution und globale Ausbreitung einzelner phylogenetischer Linien verfolgen. Wichtige Initiativen sind hier die Entwicklung eines standardisierten MLST-Schemas (Multi-Locus Sequence Typing) und der Aufbau einer weltweiten Datenbank durch das CRyPTIC TB-Konsortium.