HPV-Diagnostik: Ein bunter Methodenstrauß

Zur Prävention des Zervixkarzinoms ist der zytologische PAP-Test seit 40 Jahren etabliert. Da aber die mit dem Nobelpreis geehrte Forschung von Harald Zur Hausen und seinen Mitarbeitern beweisen konnte [1], dass das HP-Virus in 99,7 % der Fälle für die Entstehung des Zervixkarzinoms verantwortlich ist, wurde zum einen die HPV-Impfung eingeführt und mittlerweile auch das Screening auf das Zervixkarzinom und seine Vorstufen um einen HPV-Test erweitert.
Mindestens 176 verschiedene Genotypen des humanen Papillomvirus sind bekannt. 40 davon infizieren den Genitalbereich des Menschen; 18 gelten als sogenannte High-Risk-Typen (HR), da sie für einen Großteil der entstehenden Neoplasien (Präkanzerosen, Gebärmutterhalskrebs bei Frauen, Tumoren im Genitalbereich bei Männern, Kopf-Hals-Tumoren) verantwortlich sind. Die Low-Risk-Typen sind eher für die Entstehung von Feigwarzen, selten für das Cervixkarzinom verantwortlich. 
Die S3-Leitlinie zur Prävention des Zervixkarzinoms fordert für das bevölkerungsbezogene Screening den Nachweis von dreizehn Hochrisiko-HPV. Eine Genotypisierung gehört dagegen nicht dazu [2]. 

Vollautomaten

Ein bevölkerungsbezogenes Screening lässt an ein hohes Probenaufkommen und an Vollautomaten denken, die dieses hohe Probenaufkommen schnell und zuverlässig abarbeiten. 
Ideal ist natürlich, wenn die Proben im Primärröhrchen mit einem Minimum an Hands-on-Time in den Automaten gestellt werden können. Ein vorgestelltes System identifiziert 15 HR-HPV-Typen mittels Real-time PCR und ist für das Primärscreening geeignet. 
Ein mRNA-basierter Test, der ebenfalls auf einem Vollautomaten durchgeführt wird, weist die für die beiden viralen Onkoproteine E6 und E7 kodierenden mRNAs mittels eines Hybridisierungsschritts und anschließender isothermaler transcription mediated amplification (TMA) nach. Während die Viruslast zu Beginn einer Infektion hoch ist und dann sinkt, verhält es sich mit der mRNA umgekehrt: Deren Konzentration im Epithel ist zu Beginn der Infektion gering und steigt mit dem Fortschreiten der Erkrankung an. Deshalb spricht ein positiver mRNA-Nachweis für eine Infektion mit einem höheren Progressionsrisiko. Die Rate falsch-positiver Ergebnisse soll mit dieser Methode darüber hinaus niedriger liegen als beim Nachweis der Virus-DNA [3].

HPV und weitere STI 

Ein gut etabliertes NAT-System kann unter der Verwendung vorgefertigter Assay-Kits das Screening ebenso schnell durchführen – möglicherweise mit ein paar Arbeitsschritten mehr. Idealerweise läuft der komplette Workflow in einem geschlossenen, vor Kontaminationen geschützten System ab, dem nur die Probe zugefügt wird, bevor die Reaktion unter den konstanten Bedingungen des Analyzers innerhalb einer Stunde bis zum Resultat abläuft. Das System gibt es in unterschiedlichen Größen.
Bei einem weiteren schnellen Verfahren, das sich für das Primärscreening eignet (15 HR-HPV-Typen), handelt es sich um ein isothermales NAT, das aus Flüssig- und Trockenabstrichen (z. B. für Oropharynx-Abstriche) sowie FFPE(Formalin-fixierte Paraffin-gebettete)-Gewebe durchgeführt werden kann. 
Die Entstehung eines Cervixkarzinoms nach einer HPV-Infektion kann durch verschiedene Faktoren begünstigt werden. Dazu zählt eine Koinfektion mit weiteren sexuell übertragbaren Erregern (STI). Deshalb kann es sinnvoll sein, das Screening auf weitere STI auszudehnen – idealerweise innerhalb eines Reaktionsansatzes. Dann ist allerdings ein gutes Multiplexing erforderlich. 

Mehr als Ja oder Nein

Die genaue Bestimmung der an einer HPV-Infektion beteiligten Genotypen ist im Rahmen des Cervixkarzinom-Screenings nicht vorgeschrieben, kann aber unter bestimmten Bedingungen sinnvoll sein. Für den Line-Probe-Assay sind in definierten Abständen auf einem Nylonstreifen DNA-Sonden gegen charakteristische Sequenz­regionen aus dem L1-Open-Reading-Frame der unterschiedlichen Genotypen immobilisiert. Aus der zu untersuchenden Probe werden mittels PCR kurze, nur 65 Basenpaare umfassende Amplifikate hergestellt, zum Pairing mit den DNA-Sonden eingesetzt und letztendlich in einer Farbreaktion sichtbar gemacht. Die kurzen Amplifikate haben sich besonders für bereits leicht zerstörtes FFPE-Gewebe bewährt, da sich die Sensitivität der DNA-Detektion mittels PCR umgekehrt proportio­nal zur Größe der Amplifikate verhält [4]. Die Amplifikate sind biotinyliert, um die Hybridisierung durch die Zugabe von Streptavidin letztendlich sichtbar zu machen. 
Eine weitere Genotyping-Methode ist der Mikroarray. Auch hierzu werden Oligonukleotid-Sonden auf einer Festphase immobilisiert, um die unterschiedlichen HPV-Genotypen mittels Hybridisierung mit Fluoreszenz-markierten NAT-Amplifikaten unter Verwendung der HPV-Regionen E6 und E7 nachzuweisen. Für jeden HPV-Typ gibt es dabei ein eigenes Primer- und Sondensystem, das einen spezifischen und sensitiven Nachweis der unterschiedlichen Genotypen erlaubt. Die Auswertung der resultierenden Fluoreszenzsignale auf den Biochips erfolgt automatisch mithilfe eines Scanners.
Eine dritte Genotyping-Methode im Rahmen dieser Produktübersicht setzt die Probe ohne Aufreinigung nach der DNA-Isolierung sofort in die isothermale Nachweisreaktion ein. Das Pairing von Sonde und Amplifikaten wird in Echtzeit als Fluoreszenz für 15 HR-HPV-Genotypen innerhalb von 1,5 Stunden detektiert.

Ab ins LIS

All diese Ergebnisse gilt es schnell und sicher zu dokumentieren – und zwar dem jeweiligen Patienten sicher zugeordnet und für alle am Prozess beteiligten Personen bequem einsehbar. Mit anderen Worten – es geht um eine gute Dokumentation. Darüber hinaus sollte auch das Ergebnis der Zytologie genauso zur Verfügung stehen. Das ist gleichzeitig eine gute Plausibilitätskontrolle. Dies ist die Aufgabe des Laborinformationssystems. Zusätzlich werden im Hintergrund alle Informationen für die Abrechnung der Leistung mitgeführt.

Dr. Gabriele Egert
Mitglied der Redaktion